《Annual Review of Pathology-Mechanisms of Disease》：Gasdermins, Executors of Pyroptosis: A Decade in Perspective
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本文是国际权威期刊《Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease》上发表的一篇重磅综述，对过去十年gasdermin（GSDM）蛋白作为程序性细胞焦亡核心执行者的研究进行了全景式回顾与深刻剖析。文章系统梳理了GSDM家族的激活机制（如蛋白酶切割、翻译后修饰）、复杂的调控网络及其在癌症、心血管疾病、自身免疫病等多种人类疾病中的关键作用，并前瞻性地指出了将该领域基础研究成果转化为临床治疗策略（如特异性抑制剂开发）所面临的挑战与未来方向，为相关领域的研究者与药物研发人员提供了极具价值的路线图。
Gasdermin蛋白：细胞焦亡的执行者——一个十年的视角
引言
在成年人体内数万亿的细胞中，每天有约500-700亿个细胞经历稳态更新。这些细胞的生命始于干细胞群体的诞生，终于通过一系列机制走向死亡，这些机制范围从细胞内在的调节过程到具有系统性后果的灾难性细胞破坏。对细胞死亡的分子研究始于1972年Kerr及其同事对凋亡的原始描述。然而，人们也观察到了一种涉及细胞膜气球样膨大和裂解的形态学上截然不同的细胞死亡形式。针对特定触发因素（例如鼠伤寒沙门氏菌暴露、缺血或ATP耗竭）的一种特异性坏死性细胞死亡模式，因其启动因子和伴随的炎性细胞因子释放，被命名为焦亡（pyroptosis）。
在随后的几年里，超过十几种细胞死亡方式被分子表征和分类。其中几种方式呈现坏死性细胞形态，并被发现利用成孔蛋白作为其终末（或接近终末）步骤，类似于补体膜攻击复合物或穿孔素的作用，从而导致细胞梯度丧失和膜稳定性破坏。Gasdermin D（GSDMD）作为gasdermin家族的原型成员，在2015年被鉴定为焦亡这一长期缺失的终末效应物。自那时起，大量专注于gasdermin生物学基础机制的研究开始揭示其在临床相关性方面的广泛证据。
Gasdermin的激活机制
早期研究
“Gasdermin”一词源于最初在胃肠道和皮肤系统中表达的发现。2015年，三项研究证实了GSDMD是焦亡性细胞死亡和白介素-1β（IL-1β）释放所必需且基本充分的蛋白。GSDMD被发现通过切割在下游多个炎症通路中被激活，要么通过炎症小体复合物和炎症蛋白酶caspase-1（CASP1），要么在识别细菌脂多糖后直接由CASP4/5（小鼠中为CASP11）切割。切割释放了GSDMD的氨基末端和羧基末端片段，解除了氨基末端GSDMD结构域的自抑制，该结构域是焦亡性细胞死亡的启动子。Shi等人进一步表明，GSDMD是炎症性caspase的唯一GSDM家族成员靶点。相比之下，随后发现其他gasdermin被多种其他蛋白酶切割。不久之后，GSDMD在Asp275（人GSDMD）位点被激活切割后作为膜孔的功能在2016年被多个研究组确立。激活的GSDMD多聚化在质膜上形成孔道，导致坏死形态和随后的裂解性细胞死亡，并伴有炎性细胞因子释放。这些研究扩展到其他gasdermin成员，确定除了pejvakin（PJVK）之外，所有gasdermin家族成员在过表达系统中基于脂质体渗漏测定和焦亡气泡形成等读数都能引起焦亡性死亡。这些研究确立了GSDMD作为多种病理和疾病基础炎症通路中的关键角色。
2017年，两项研究发现GSDME被凋亡执行者caspase CASP3切割和激活。冯邵团队在多种化疗药物处理的原代人细胞和NCI-60人癌细胞系面板中表征了GSDME在Asp270位点的切割。Rogers等人将这些发现扩展到对内在和外在凋亡以及水疱性口炎病毒感染的反应中的激活。这些发现为正在形成的概念奠定了基础，即凋亡caspase激活不再仅仅与凋亡形态或细胞死亡相关联，这一过程现在通常被称为凋亡向焦亡的转换或其变体。激活剂和效应物从先前孤立的通路“交叉”影响其他形式细胞死亡的观点是一个重要概念，具有重大的治疗意义，也是细胞死亡研究的一个主要混杂因素。
Gasdermin激活的变奏
随着时间的推移，人们发现gasdermin家族成员的激活不仅仅是一个细胞内在的过程，因为与“非我”和先天免疫系统其他成分的相互作用也被发现会导致gasdermin激活。例如，杀伤细胞蛋白酶颗粒酶B被证明在肿瘤细胞中CASP3切割位点激活GSDME依赖性焦亡，实际上起到了肿瘤抑制的作用。同样，来自细胞毒性淋巴细胞的颗粒酶A切割GSDMB。在癌症治疗领域，黄实验室发现，嵌合抗原受体T细胞疗法的一种潜在致命不良反应——细胞因子释放综合征，可归因于巨噬细胞中GSDME被颗粒酶B切割后引发的CASP1–GSDMD激活级联反应。此外，在某些肿瘤环境的缺氧条件下，程序性死亡配体1可以易位到细胞核，转录激活GSDMC基因。这种GSDMC表达随后在肿瘤坏死因子暴露下导致细胞死亡从凋亡切换到焦亡。因此，gasdermin在癌症中的作用可能取决于肿瘤的炎症和营养环境。
对先天免疫的进一步研究揭示，感染性生物体也以新颖的方式与gasdermin相互作用，这些方式超出了先前认识到的模式识别受体-炎症小体-CASP1-GSDMD信号轴。例如，占主导地位的角质形成细胞gasdermin GSDMA被A组链球菌蛋白酶SpeB（一种毒力因子）在Gln246位点切割，产生的N端结构域以类似于GSDMD的方式触发焦亡。耶尔森菌假结核病蛋白YopJ抑制关键细胞激酶TAK1，触发CASP8依赖性细胞死亡。在这种情况下，发现CASP8在CASP1切割位点Asp275切割并激活GSDMD。甚至最近有研究表明过敏原含有能够激活GSDMB的蛋白酶。因此，几乎可以肯定，许多感染因子能够在多种细胞生态位和疾病背景下影响gasdermin切割和坏死性细胞死亡。
Gasdermin激活与细胞死亡执行中的交互对话
通过对gasdermin调控机制的深入研究，很快就变得明显，gasdermin激活通路并非存在于真空中。在上述研究中，Sarhan等人意外地发现，在耶尔菌引起的CASP8介导的GSDMD切割过程中，同时存在CASP8对CASP3的切割，导致GSDME激活。这种gasdermin的双重激活在Broz实验室的一项后续研究中也得到证实，该研究表明在该系统中，主要炎性细胞因子IL-1β的释放依赖于这种次级激活的GSDME，而不仅仅是初始的GSDMD切割，这表明炎症性caspase和凋亡性caspase之间存在相互作用和协作。
与炎症小体同时激活gasdermin相反，在其他背景下，gasdermin和其他成孔/通道形成蛋白似乎通过直接CASP4/5切割发生顺序激活，这一过程称为非经典途径。在该途径中，细胞暴露于脂多糖会触发GSDMD激活，依次导致GSDMD孔形成、钾外流和NLRP3炎症小体激活，从而放大原始的LPS信号。值得注意的是，最近的研究表明IL-1β和IL-18也是人CASP4/5的靶点，但来自不同来源的孔形成后，继发的NLRP3–CASP1–GSDMD活性的原理是通过连续激活进行细胞死亡交互对话的决定性特征。
Gasdermin生物学中的调控机制
空间调控
Gasdermin作为膜成孔蛋白的主要功能依赖于与甘油磷脂双分子层膜的特异性相互作用。Gasdermin的切割暴露了与膜甘油磷脂相互作用的氨基酸，并将gasdermin靶向特定的膜结构域。Gasdermin优先与带负电荷的甘油磷脂结合，特别是磷酸、信号脂质磷脂酰肌醇4,5-二磷酸以及复杂的磷脂心磷脂，后者在线粒体和细菌膜中普遍存在。GSDMB还独特地结合硫酸化糖磷脂硫苷脂，这有助于其在胃肠道系统中的关键作用。
这些初步发现暗示了gasdermin基于其结构以及细胞中膜的分布和组成而具有靶向偏好性。一项开创性研究发现，GSDMD和GSDME的切割导致线粒体定位和透化。然而，这种能力在gasdermin中并不均等。我们发现GSDMA在此过程中优先靶向线粒体，而其他人则发现GSDMD依赖性线粒体孔形成对于焦亡信号传导的传播和放大是必要的。甘油磷脂与gasdermin的关联并未引起最多的关注，已发表的工作大部分是在人工脂质纳米颗粒中进行的。然而，最近对gasdermin棕榈酰化的研究重新激发了人们对gasdermin和甘油磷脂之间相互作用兴趣。
动力学调控
历史上，凋亡一直被认为是一种全有或全无的反应。对于焦亡，已经变得明显，需要达到临界数量的gasdermin孔才能触发细胞死亡，尽管这个阈值尚未明确定义。早期证据表明，树突状细胞能够在鼠源CASP4/5同源物激活时释放白细胞介素，同时保持存活，这种状态被称为超活化。在GSDMD的基本功能得到更多确立后，Kagan实验室在2018年随后在巨噬细胞中用强效NLRP3炎症小体激活剂尼日利亚菌素刺激时也观察到了同样的现象，导致了GSDMD依赖性孔形成和IL-1β释放。这些发现背后的工作假设是，没有达到导致明显细胞裂解的孔形成的定量临界质量，因此被称为gasdermin的亚裂解性或非裂解性激活。我们也证明了巨噬细胞中GSDME的亚裂解活性以及亚裂解性IL-1β释放可以先于并进展为完全裂解。
已经描述了两种抵消gasdermin的膜修复过程，从而限制gasdermin在质膜中的积累。一种是通过ESCRT（运输所需的内体分选复合体）机制稳态分泌受影响的膜。该过程由膜损伤（即通过孔的传导活性）后细胞内钙增加触发，并通过囊泡脱落导致质膜密封。第二个过程也由钙内流刺激，涉及受损质膜的内吞作用以延迟焦亡。具体来说，先前被认为是残留细胞通路的、被CASP1切割的CASP7激活的酸性鞘磷脂酶的胞吐作用，被发现能产生局部浓度的神经酰胺，诱导受损膜的内吞，延迟焦亡性细胞死亡，直到受损的肠上皮细胞被挤入管腔。
除了上述两种临时措施外，细胞还有两种通过直接抑制gasdermin依赖性裂解活性来起作用的机制。一种是通过caspase对gasdermin N端结构域进行切割依赖性失活。一项研究报告了pan-caspase在Asp91位点使GSDMB失活，而Taabazuing等人确定凋亡机制通过在Asp87位点抢先切割使GSDMD失活，从而关闭潜在的GSDMD激活。在多种活性通路的背景下，例如炎症小体依赖性CASP1和CASP8激活或上述CASP7激活，这些切割的动力学似乎有利于焦亡的凋亡性失活。
最后，最近的研究表明，gasdermin可能不是裂解性细胞死亡的最终决定者。发现小膜结合蛋白ninjurin-1是细胞下游多种坏死性细胞死亡机制（从焦亡到坏死性凋亡和铁死亡）中完全质膜破裂所必需的。被认为是由氨基酸甘氨酸长期已知但知之甚少的抑制质膜破裂的基础，NINJ1膜裂解直到最近才在一系列描述其活性结构基础的开创性研究中得到阐明。目前认为，gasdermin诱导的细胞气球样变允许大得多的NINJ1孔寡聚化，可能通过“饼干切割”机制溶解质膜。
翻译后调控
蛋白质的共价修饰是一种普遍的生物学调节过程。除了gasdermin，经典炎症小体途径的其他成分也经历翻译后修饰。最近描述的GSDMD的SUMO化。GSDME在Thr6的磷酸化是早期详细探讨的gasdermin改变，这种修饰在过表达模型中抑制寡聚化但不影响向质膜的定位。进一步的研究表明，该磷酸化事件由AMP激活激酶催化，并起到抑制CASP3结合和切割的作用。重要的是，这一见解具有临床转化意义，因为在化疗背景下使用AMPK激活剂甘露糖治疗，减少了非恶性组织和器官中脱靶的GSDME依赖性焦亡。同样，发现GSDMA的Thr8（与GSDME的Thr6同源）是过表达系统中膜渗漏所必需的。最后，同时发现GSDMD在Ser46位点被AMPK磷酸化，尽管这项工作的大部分也是在依赖N端结构域过表达的研究中进行的。
Gasdermin被脂肪酸棕榈酸酯修饰最近被表征并引起了强烈兴趣。GSDME的棕榈酰化最初是在其C端结构域中描述的。其他研究表明所有gasdermin都被棕榈酰化。在GSDMD中，这优先发生在Cys191位点，并被活性氧诱导的棕榈酰转移酶活性增加所增强，特别是在焦亡期间靶向线粒体的GSDMD中。额外的研究做出了其他几个重要的观察。对于GSDMD活性，棕榈酰化不依赖于切割，因为全长未切割的棕榈酰化gasdermin可以形成活性孔，而非棕榈酰化的N端结构域的成孔能力严重减弱。此外，Zhang等人发现出乎意料的是，去棕榈酰化是GSDMD孔活性所必需的，因此得出结论，在棕榈酰化GSDMD靶向膜后，这种翻译后修饰的逆转允许在Cys191位点进行进一步的修饰，以促进下游的寡聚化步骤。这个特定半胱氨酸残基的重要性在于治疗性处理和内源性调控相互作用的中心，因为它已被用于药理学靶向。
药理学调控
炎症长期以来被认为是健康和疾病的重要组成部分。在本世纪之交，针对特定炎症调节剂的生物制剂的问世标志了对抗疾病的药理学斗争的一个转折点，始于TNF抑制剂和IL-1受体拮抗剂阿那白滞素。
最近深入综述了针对GSDMD和炎症小体途径中其他蛋白质的药物的发现。与炎症小体抑制剂的开发相比（炎症小体复合物于2002年发现，但第一个临床前NLRP3抑制剂MCC950直到2015年才被表征，晚了13年），寻找GSDMD抑制剂的速度显著更快。2018年，半胱氨酸反应剂necrosulfonamide被证明通过在Cys191位点共价修饰来抑制GSDMD。发现这种效应可阻断寡聚化，与最近对同一站点棕榈酰化的研究一致。值得注意的是，GSDMD中的Cys191位点在其他gasdermin中不保守。随后的两年中，另外两种半胱氨酸反应性药物在GSDMD抑制方面得到了类似的表征。Lieberman和吴实验室发现美国食品和药物管理局批准的抗酒精中毒药物双硫仑以类似的方式作用于GSDMD，尽管不能排除炎症小体途径中的一些其他脱靶效应。不久之后，Kate Fitzgerald的团队发现多个GSDMD半胱氨酸被内源性代谢物琥珀酸翻译后修饰，并且外源性富马酸二甲酯能够介导这一过程。发现这种效应也延伸到GSDME。然而，该药物复杂的药代动力学可能限制其整体疗效。
这些初步发现引发了对gasdermin抑制的目标和局限性的广泛讨论，并存在许多注意事项。大多数动物模型的临床前后续研究都集中在GSDMD抑制上，排除了其他gasdermin。作为炎症小体激活的终末（或NINJ1近期报告后的倒数第二个）效应物，GSDMD并非导致其切割、易位到质膜和细胞死亡的一系列事件中的唯一参与者。因此，抑制如此下游的通路不一定反映药物治疗的全部潜力，特别是考虑到上游成分的不同抑制剂正在高级开发中。同样，没有炎性疾病被唯一归因于GSDMD种系突变，这与炎症小体成分的几种疾病形成对比。作为一个额外的混杂因素，重要的细胞证据表明gasdermin激活存在重叠，因此在复杂疾病状态下抑制单个gasdermin可能效果甚微。最后，描述的大多数全局半胱氨酸修饰药物都有一定程度的脱靶效应。
直接解决最后一点，最近一波GSDMD抑制剂是通过小分子筛选发现的。一种未表征的药物C202–2729被认为可结合GSDMD Tyr54和Lys235，并通过阻止GSDMD与质膜结合改善了许多炎症小体激活的细胞后果，值得注意的是，不影响成孔N端结构域的产生。类似地，GI-Y1/GI-Y2在叶的一系列论文中被认为靶向Arg11和Arg10。虽然这些药物尚未经过广泛验证，但杨实验室使用了一种筛选已验证药物的替代策略，彻底表征了一种血管内皮生长因子受体抑制剂和一种抗生素对GSDMD依赖性效应的抑制。这些药物也以非共价方式结合N端结构域的不同残基，并且对GSDME没有影响。需要进一步的临床前研究来确定这第二代抑制剂是否在临床使用中可行。
关于翻译后修饰和gasdermin蛋白治疗学的相互作用，许多问题仍然存在。特别令人感兴趣的是多个反应性半胱氨酸在内源性修饰（如棕榈酰化）方面的混杂性、在生物学功能中的关键性以及被第一类gasdermin抑制剂靶向。我们认为，翻译后化学计量的概念需要对gasdermin进行批判性评估，特别是考虑到这些因子的重叠活性。对于抑制GSDMD作为炎症小体激活的下游效应物，我们持谨慎乐观态度，因为药物发现管线中已有的其他抑制剂具有更近端活性。然而，其他gasdermin家族成员的特异性抑制剂仍有待发现，并且可能会找到独特的用途，因为特别是GSDMB和GSDMC的基础生物学仍然相对较少被理解。
从实验室到临床
将当前gasdermin生物学的发现转化为临床应用提出了挑战，因为gasdermin的功能、冗余性和相互作用具有复杂性。在进化上，gasdermin同源物存在于单细胞生物甚至病毒中，其功能多样，从劫持宿主免疫系统到生物体自杀，再到防止噬菌体复制。在人类中，复杂性高出一个数量级。虽然gasdermin存在于大多数组织中，但其功能可能在健康个体和疾病状态（如感染、（自身）免疫和恶性肿瘤）中有所不同。支持gasdermin参与个体系统和组织的证据不断被评估。
有几种因素使得清晰界定gasdermin在疾病中的作用变得复杂。首先，小鼠和人类表达不同的gasdermin蛋白互补组：可能由于基因复制，小鼠有三个GSDMA旁系同源物和四个GSDMC旁系同源物，但没有GSDMB。因此，在特定gasdermin上对小鼠进行的研究转化为人类的效果可能有所不同。其次，GSDMB具有多种异构体，命名不标准，引发焦亡的能力各不相同，目前尚不清楚基因敲入小鼠是否会对转基因变体具有适当的调节机制。第三，最初的研究不成比例地在小鼠骨髓来源的巨噬细胞中进行；必须谨慎地进行这些数据和通路的推断，因为我们知道具有不同膜区室的细胞对gasdermin激活有不同的反应。第四，人类组织中gasdermin的分布很复杂：一般来说，GSDMD分布广泛，在免疫细胞中研究最多；GSDME存在于多种组织类型中；GSDMB异构体大量参与胃肠道系统；GSDMA经典上与皮肤相关，GSDMC也主要存在于其中。
Gasdermin的转录调控才刚刚开始被理解。从2019年发现干扰素调节因子1和2控制GSDMD表达开始，已经发现了其他几种已知的gasdermin表达调节因子，无论是在基础水平还是在响应炎症刺激期间。另一方面，GSDME的表观遗传调控早已为人所知。在结直肠癌和其他癌症中，GSDME的表达因其启动子的高甲基化而沉默。在通过靶向gasdermin治疗疾病时，了解gasdermin表达模式至关重要，尤其是在治疗上期望刺激死亡的背景下。
Gasdermin在恶性肿瘤中的作用
Gasdermin在人类多种癌症中的功能多种多样，有时甚至是相反的，范围从肿瘤进展到抑制和杀死恶性细胞。在gasdermin作为焦亡执行者被发现之前很久，就发现GSDMC表达与更差的黑色素瘤指标相关。同样，GSDMB异构体被证明可促进乳腺癌的迁移和肿瘤进展。现在正在分子水平上证实这些非焦亡作用，特别是对于GSDMB。大量间接证据表明gasdermin在促进肿瘤发生本身中起作用，但确凿证据很少。
Gasdermin杀伤癌症的想法引起了更多的兴趣。GSDME作为化疗诱导的焦亡效应物的初步描述，推动了GSDME介导的细胞死亡在多种癌症中的广泛表征。不那么突出的是上述（“Gasdermin激活的变奏”部分）描述的少数关于颗粒酶依赖性激活靶细胞GSDMB和GSDMD的研究。在我们看来，虽然这些研究对于标记和分类化疗药物对人类大量恶性肿瘤的多种影响很重要，但正在达到收益递减点。利用这些已获得知识的下一阶段可以沿着多个研究途径进行。一些可能性是：专注于基于机制的癌症预后和诊断学；使用精准医学概念（即基于不同gasdermin的表达）评估和预测癌症对治疗的反应；
