《Annual Review of Entomology》：Insect-Specific RNA Viruses of Agricultural Pest Insects: Diversity, Evolution, Function, and Potential Applications
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本文系统综述了近十年来利用宏转录组学在农业害虫中新发现的大量特异性感染昆虫的RNA病毒（Insect-specific viruses, ISVs）。文章深入探讨了这些ISVs与植物病毒的进化关联、与宿主的长期共演化关系，并重点总结了ISVs对害虫宿主生物学功能（包括致病性、媒介能力、雄性致死、行为生理调控等）的复杂影响。最后，本文展望了将非杆状病毒（Nonbaculoviral）ISVs开发为新型生物防治剂用于控制害虫及植物病毒病的巨大潜力，为该前沿领域的未来研究提供了清晰的指引。
农业害虫特异性RNA病毒（ISVs）的多样性、进化与功能
引言：一个被长期忽视的病毒世界
地球上的昆虫物种估计约有550万种，构成了已描述动物物种的一半以上，其中80%尚待发现。昆虫是多种病毒的携带者，包括感染动植物的虫媒病毒，以及一类被称为昆虫特异性病毒（Insect-specific viruses, ISVs）的病毒。ISVs局限于昆虫体内，不能在脊椎动物或植物宿主中复制。首个ISV于50年前在蚊子细胞培养物中被发现。然而，长期以来，研究焦点主要集中于具有医学和农业重要性的虫传病原病毒，ISVs常被忽视。近年来，大规模测序技术、人工智能和生物信息学工具的进步，通过无偏倚的宏转录组学方法，极大地扩展了我们对ISVs，特别是RNA病毒的认知。值得注意的是，ISVs的宿主范围不仅限于昆虫，还可延伸至其他节肢动物甚至非节肢无脊椎动物。ISVs采用垂直和水平传播策略来确保其在自然界昆虫宿主中的存续。大量ISVs的发现显著推动了病毒分类学，填补了RNA病毒系统发育进化枝的主要空白，并增进了我们对病毒-宿主进化关联的理解。越来越多的证据表明，感染动植物的病原病毒可能是由ISVs在进化过程中通过多次跨物种水平传播事件演化而来。此外，ISVs的存在能够影响其昆虫宿主的行为和表现，并可能影响其传播病原病毒的媒介能力。这一发现为探索将非杆状病毒的ISVs用作害虫和虫媒病毒病新型生物防治剂开辟了新的可能性。本篇综述旨在梳理ISVs的研究进展，聚焦农业害虫中的RNA病毒，并对这一新兴领域提供见解。
ISVs与植物病毒及宿主昆虫的进化关系
植物RNA病毒起源于ISVs的水平病毒转移（HVT）
植物病毒对全球粮食安全构成重大威胁，给世界各地的农作物造成巨大的经济损失。系统基因组学分析显示，植物RNA病毒形成分支，嵌套在更广泛的ISVs辐射之内，这有力地支持了ISVs通过水平病毒转移（Horizontal virus transfer, HVT）成为相关植物病毒祖先的假说。类似于医学上重要的虫媒病毒中常见的昆虫-脊椎动物HVT情景，昆虫-植物的植物RNA病毒HVT也得到了越来越多的证据支持，包括许多与植物病毒密切相关的ISVs，以及昆虫基因组中源自植物病毒的内源性病毒元件。相反，尽管ISVs从植物病毒通过植物-昆虫HVT演化而来的可能性不能完全排除，但目前的进化、生态和分子证据并不支持这一情景。
例如，根据国际病毒分类委员会，某些植物RNA病毒谱系，如雀麦花叶病毒科的成员，传统上被认为只感染植物。然而，secoviruses在系统发育上聚集在丰富的传腐病毒科的类小RNA病毒（Picorna-like）ISVs中，形成了传腐病毒科-雀麦花叶病毒科集群，这支持了祖先secoviruses通过ISVs的HVT在植物中出现的假说。类似地，已鉴定出许多与马铃薯卷叶病毒科、烟草花叶病毒科、双分病毒科、奥赛病毒科、葡萄病毒科、番茄丛矮病毒科和基塔病毒科等植物病毒科密切相关的多样化ISVs。这些发现表明，这些科中的植物病毒很可能通过HVT起源于相应的ISVs。值得注意的是，还发现了几种在系统发育上与传腐病毒科和黄病毒科的ISVs相关联的新型植物病毒，进一步证实了昆虫-植物HVT情景。
昆虫基因组中与植物病毒具有同源性的内源性病毒元件（EVEs）为某些植物病毒谱系通过HVT从ISVs进化而来提供了关键证据。一个典型例子是Negevirus，这是一个包含感染节肢动物病毒的类群。系统发育分析表明，negeviruses与基塔病毒科和烟草花叶病毒科的植物病毒关系密切。这些病毒拥有一个包含三个开放阅读框的非分段RNA基因组，其中ORF3通常预测编码膜蛋白SP24，偶尔编码外壳蛋白，分别与基塔病毒和烟草花叶病毒科病毒的病毒蛋白同源。进一步分析表明，外壳蛋白和SP24衍生的EVEs广泛存在于各种节肢动物基因组中。尽管这些EVEs的功能尚不清楚，但这些发现表明，这两个科中的植物病毒很可能是通过HVT事件从negevirus或nege-like virus祖先演化而来的。
ISVs与宿主昆虫的共进化
经过数百万年的共进化，许多ISVs表现出高度的宿主特异性，通常局限于特定的昆虫物种或近缘类群，例如在蚱蜢、蚜虫和飞虱中发现的病毒。这种特异性表明了ISVs与其宿主之间的漫长进化史，并受到生态位和宿主遗传因素的影响。随着ISV的发现不断扩大，在昆虫基因组中鉴定出了源自非逆转录RNA病毒（nrEVEs）的多样化内源性病毒元件。作为分子化石，这些nrEVEs是垂直传播的，并可在宿主基因组中保存数百万年，为研究古老ISVs与其昆虫宿主之间的长期共进化提供了宝贵的机会。此外，可以根据同源nrEVE插入的鉴定，利用宿主物种分化时间来估算古老病毒感染的时间尺度。
一项针对48个节肢动物基因组的调查显示，nrEVEs在多种农业害虫中广泛存在，包括豌豆蚜、桔小实蝇、亚洲柑橘木虱、棉铃虫、桃蚜、小菜蛾和草地贪夜蛾。这些nrEVEs常常产生初级piwi相互作用RNA，表明它们可能通过piRNA通路参与宿主的抗病毒反应。研究还发现，与烟草花叶病毒科或nege-like virus相关的nrEVEs广泛整合到各种蚜虫物种的基因组中。同源nrEVE整合和系统发育分析表明，nege-like viruses拥有悠久的进化历史，并与蚜虫祖先在新生代时期共存。类似地，内源性类totivirus病毒元件也普遍整合到三种稻飞虱以及其他节肢动物的基因组中。对个体基因组中内源性类totivirus病毒元件的分析发现，它们在飞虱种群中具有高度可变的分布和多态性水平，表明这些内源性类totivirus病毒元件在飞虱基因组中存在多种进化情景。进一步的实验提供了令人信服的证据，证明褐飞虱中的一个内源性类totivirus病毒元件已被宿主征用，对宿主的发育和繁殖力至关重要。
ISVs在主要农业害虫中的功能
随着新发现ISV数量的不断增加，研究越来越关注这些ISVs的生物学特性和功能。ISVs的存在可能对昆虫具有致病性，影响其昆虫宿主的行为和表现，并可能影响宿主作为其他病原体媒介的能力。理解ISVs在其宿主中的生物学作用，为考虑将其作为害虫和虫媒植物病毒病的潜在生物防治剂开辟了新的可能性。
ISVs对宿主昆虫的致病性
尽管大多数ISV感染是无症状且非致死的，但来自双顺反子病毒科、传腐病毒科、α四病毒科、重排四病毒科、双分病毒科和呼肠孤病毒科的几个科的ISVs会导致农业害虫发病。
双顺反子病毒科和传腐病毒科的病毒是农业昆虫中最常见、最丰富的ISVs。双顺反子病毒科的蟋蟀麻痹病毒具有异常广泛的宿主范围。尽管CrPV在大多数昆虫宿主中的致病性目前尚不清楚，但早期实验表明，CrPV可有效杀死地中海实蝇成虫，并导致喂食CrPV的橄榄实蝇在12天内死亡率高达80%。与其密切相关的果蝇C病毒，存活率测定表明，当感染DCV时，入侵性害虫斑翅果蝇比对照组死亡更快，并且对DCV的易感性与病毒载量增加相关。另外两种双顺反子病毒，蚜虫致死麻痹病毒和禾谷缢管蚜病毒，多年前在禾谷缢管蚜中发现。禾谷缢管蚜病毒在禾谷缢管蚜种群中可经卵巢传播，并显著缩短感染蚜虫的寿命。感染蚜虫致死麻痹病毒的禾谷缢管蚜会产生与CrPV类似的症状，导致运动不协调和麻痹，随后死亡。一项田间调查表明，禾谷缢管蚜和麦长管蚜数量的急剧减少与蚜虫致死麻痹病毒感染的发生相吻合，这表明蚜虫致死麻痹病毒的存在可能限制了这两种蚜虫在田间的种群发展。此外，与无毒成虫相比，从茶翅蝽中发现的茶翅蝽肠病毒显著缩短了带毒茶翅蝽成虫的平均寿命。
传腐病毒科仅包含一个属，即传腐病毒属，其典型病毒是传染性软化病病毒，它会导致家蚕幼虫发生以致死性腹泻为特征的疾病。从透翅毒蛾中鉴定出的透翅毒蛾病毒，对从透翅毒蛾蛹卵巢建立的感染细胞系致病性较弱。感染棉铃虫传腐病毒的棉铃虫幼虫和蛹比阴性对照组发育更慢、死亡率更高，表明棉铃虫传腐病毒对宿主昆虫具有致病性。进一步的转录组分析表明，与棉铃虫传腐病毒相关的幼虫死亡率增加可能是由表皮蛋白表达下调引起的。另一种具有昆虫病原性的传腐病毒是拉霍亚病毒，它自然感染斑翅果蝇。通过胸腔注射和口服感染两种方法确定了拉霍亚病毒对昆虫宿主的致病性，表明拉霍亚病毒是一种有前景的针对斑翅果蝇的生物防治候选剂。
来自α四病毒科的棉铃虫矮化病毒对前三个龄期的幼虫具有高度致病性，导致棉铃虫幼虫迅速停止取食、生长显著延迟以及幼虫身体萎缩或矮化。然而，该病毒对最后两个幼虫阶段几乎没有影响。棉铃虫矮化病毒已被广泛研究并用作棉铃虫属害虫的生物防治剂。来自重排四病毒科的茶蚕病毒是从印度尼西亚南苏门答腊患病的茶蚕幼虫中分离出来的。茶蚕病毒的纯化病毒颗粒对日本的包括黄刺蛾在内的刺蛾科幼虫表现出高致病性。另一种未分类的ISV，果蝇A病毒，在斑翅果蝇中的致病性与传腐病毒拉霍亚病毒相似。从非洲黏虫中发现的三种类双分病毒被发现可降低其昆虫宿主的生长速度和繁殖力。通过显微注射，这些病毒能够跨感染两种新宿主：草地贪夜蛾和埃及棉铃虫。对于草地贪夜蛾，感染这些类双分病毒降低了蛹的生长速度和成虫繁殖力；对于埃及棉铃虫，观察到幼虫和蛹的死亡率增加。
来自质型多角体病毒属的ISVs是昆虫的重要病毒病原体，可导致幼虫发育迟缓和繁殖力下降。质型多角体病毒已从超过250种鳞翅目、膜翅目、双翅目和鞘翅目昆虫物种中分离出来。通过宏基因组学在蚱蜢中发现了一种新的致病性呼肠孤病毒。随后的实验表明，这种呼肠孤病毒在东亚飞蝗体内的复制会导致宿主死亡。此外，从西伯利亚松毛虫中分离出一种新的质型多角体病毒毒株，对其宿主昆虫具有高毒力。重要的是，该质型多角体病毒毒株具有相对较宽的宿主范围，可作为有前景的鳞翅目害虫防治候选剂。
ISVs对媒介能力及其他病原体毒力的影响
与经过深入研究的胞内共生菌沃尔巴克体类似，ISVs会影响重要虫媒病毒的媒介能力。这些研究大多集中在蚊子，而ISVs对农业昆虫传播植物病毒的影响则鲜有报道。水稻条纹病毒在其昆虫媒介灰飞虱体内的积累受到一种昆虫类小RNA病毒Himetobi P病毒的促进，可能是通过水稻条纹病毒的核糖核蛋白与Himetobi P病毒的VP1蛋白之间的相互作用实现的。褐飞虱感染一种白纤病毒科的ISV，可通过自然取食促进水稻齿叶矮缩病毒的获得，尽管其分子机制有待进一步研究。由电光叶蝉传播的水稻矮缩病毒感染改变了其昆虫宿主一种新型传腐病毒的病毒载量和感染率，表明植物病毒可能对抗ISV感染。一种昆虫DNA病毒，桃蚜夜来香浓核病毒，可能通过增加蚜虫媒介的运动活性和种群增殖来促进马铃薯Y病毒的传播。这些结果表明了利用ISVs控制农业昆虫媒介及其传播的植物病毒的可能性。
除了对植物病毒的影响外，ISVs还与其昆虫媒介中的植物病原细菌相关。一个典型例子是由韧皮部限制性细菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”引起的黄龙病，它由亚洲柑橘木虱传播。在亚洲柑橘木虱的各种器官中鉴定出一种类黄病毒Diaphorina citri flavi-like virus，并与“Ca. Liberibacter asiaticus”共定位。此外，在田间采集的样本中观察到亚洲柑橘木虱体内Diaphorina citri flavi-like virus和“Ca. Liberibacter asiaticus”的共同存在，并且呈正相关，表明在昆虫媒介中Diaphorina citri flavi-like virus与“Ca. Liberibacter asiaticus”之间存在潜在关联。进一步的研究表明，Diaphorina citri flavi-like virus促进了“Ca. Liberibacter asiaticus”在若虫阶段的获取和在成虫阶段的传播，表明该ISV有助于植物病原细菌在昆虫媒介中的传播。
杆状病毒是昆虫大型双链DNA病毒，被广泛用作有价值的害虫生物防治工具，特别是对于鳞翅目昆虫宿主。ISVs影响几种蛾类害虫中杆状病毒的致病性。口服感染实验表明，一种新的类小RNA病毒可能对感染杆状病毒的透翅毒蛾幼虫死亡率具有协同效应。另一个例子是甜菜夜蛾传腐病毒1与一种致病性杆状病毒甜菜夜蛾多粒包埋型核多角体病毒在其甜菜夜蛾宿主中的关联。电子显微镜和后续实验表明，甜菜夜蛾传腐病毒1病毒粒子存在于甜菜夜蛾多粒包埋型核多角体病毒的包涵体内，并且甜菜夜蛾传腐病毒1的感染降低了甜菜夜蛾多粒包埋型核多角体病毒在甜菜夜蛾中的致病性。此外，非洲黏虫感染类双分病毒可增强宿主对非洲黏虫核多角体病毒的抗性。相反，当这些类双分病毒跨感染到草地贪夜蛾时，新昆虫宿主对草地贪夜蛾多粒包埋型核多角体病毒的易感性增加。
ISVs作为害虫的新型雄性致死因子
雄性特异性致死现象导致各种节肢动物中出现母系遗传的雌性偏性性别比，通常由沃尔巴克体等共生细菌诱导。2008年报道了一种由两个RNA序列组成的新型因子，可导致茶长卷叶蛾晚期雄性死亡。后来，在果蝇中发现了一种类似的母系传播的非细菌性雄性致死表型，该因子被怀疑是一种母系遗传的类病毒元件。随后，茶长卷叶蛾雄性致死因子的RNA序列被纯化并鉴定为Osugoroshi viruses，这是一类双分病毒科的新型ISVs，证实了双分病毒与昆虫晚期雄性致死表型的关联。此外，果蝇中的雄性致死现象是由一种包含四个基因组片段的共生双分病毒诱导的。进一步的研究表明，由该双分病毒dsRNA4编码的一种蛋白质是果蝇雄性致死表型的必要且充分条件。除了双分病毒科的ISVs，还发现了一类与光滑病毒目密切相关的未分类ISVs中的一种母系遗传RNA病毒。该病毒选择性地杀死斜纹夜蛾的雄性胚胎，导致只产生雌性后代，表明多样化的ISVs可能在各种害虫中充当新型雄性致死因子。
ISVs对宿主昆虫行为及生理的影响
病毒病原体或共生体的感染可以直接或间接地改变昆虫宿主的行为，以增强其传播和生存。例如，禾谷缢管蚜病毒影响蚜虫的嗅觉行为，增加它们对蚜虫警报信息素的敏感性。结果，被感染的蚜虫更容易离开宿主植物。此外，禾谷缢管蚜病毒缩短了蚜虫宿主的寿命和种群增长率，使被感染个体更容易受到捕食或天敌的攻击。另一种水平传播的ISV，橘蚜类小RNA病毒，影响褐柑橘蚜取食时的口针穿刺活动，延长了细胞间穿刺所需的时间。这种适应促进了病毒在蚜虫种群间的传播，利用植物作为中间宿主。在寄生蜂中，ISVs操纵蜂类宿主的行为。瓢虫茧蜂麻痹病毒是寄生蜂瓢虫茧蜂的一种新型传腐病毒，在寄生蜂幼虫发育期间传播给其瓢虫宿主。瓢虫茧蜂麻痹病毒在瓢虫的神经组织中复制，诱导严重的神经病变，这与受感染的瓢虫观察到的麻痹症状相关。这一发现表明，对瓢虫宿主的行为操纵是由瓢虫茧蜂麻痹病毒间接介导的。
多项研究表明，ISVs影响昆虫的生理及其对宿主植物的适应性。蚜虫布尼亚病毒1具有广泛的宿主范围，至少在10种蚜虫中复制。较高的蚜虫布尼亚病毒1滴度缩短了若虫发育时间，并显著影响豌豆蚜的脂质和蛋白质含量。此外，从外寄生蜂中鉴定出一种来自蟋蟀麻痹病毒属的新型双顺反子病毒Rondani's wasp virus 1。尽管Rondani's wasp virus 1似乎对蜂类没有有害影响，但它可以感染果蝇，即果蝇的宿主。在果蝇中，Rondani's wasp virus 1延长了蛹的发育时间，增加了繁殖力，但降低了羽化率。另一项研究发现，从蛹金小蜂中分离的一种ISV增加了成虫寿命，并通过减少雌性后代数量来影响后代性别比例。此外，除了在果蝇中的致病性外，果蝇A病毒还通过Sting依赖的NF-κB信号通路破坏肠道稳态，加速感染宿主的衰老。一些媒介昆虫的ISVs可以在昆虫取食期间水平传播到植物，尽管它们不能在植物宿主中复制。例如，豌豆蚜的一种类小RNA病毒Acyrthosiphon pisum virus通过显著提高在植物宿主中的存活率来促进蚜虫适应。这种效应可能与病毒抑制植物激素茉莉酸和茉莉酸-异亮氨酸水平的能力有关。
ISVs在害虫防治中的潜在应用与未来展望
ISVs通常具有宿主特异性，其中一些表现出昆虫病原特性，使其成为害虫管理中环境友好型微生物防治剂的潜在候选者。其中，杆状病毒是研究最深入的大型DNA病毒，被用作生物杀虫剂来控制鳞翅目害虫，已有全面综述。要使一种昆虫病原病毒成为一种有效的田间应用生物防治剂，它必须能有效感染目标害虫、可水平传播、具有高毒力，并且作用迅速以限制取食危害。然而，虽然许多非杆状病毒的ISVs，特别是RNA病毒，已显示出对其昆虫宿主的致病性，但只有少数成功应用于田间。一个显著的例子是四病毒，它可以导致害虫种群数量急剧下降。通过喷洒棉铃虫矮化病毒感染幼虫的水悬液，在田间的成功应用在高粱上防治棉铃虫得到了证实。值得注意的是，棉铃虫矮化病毒的效果与商品化的杆状病毒相当。来自呼肠孤病毒科的质型多角体病毒已被用于田间防治鳞翅目害虫，尽管有些质型多角体病毒会引起慢性感染。一种基于质型多角体病毒的产品Matsukemin，在1974年至1995年间在日本用于防治赤松毛虫。另一种质型多角体病毒Norape argyrrhorea CPV对南美油棕种植园的主要食叶害虫Norape argyrrhorea表现出高毒力。田间施用Norape argyrrhorea CPV导致幼虫迅速停止取食和害虫高死亡率，有效地将害虫种群维持在危害阈值以下。
关键研究方向
尽管通过宏基因组学方法在农业害虫中发现了大量新型ISVs，但它们的基本生物学特性——如宿主范围、传播方式、病毒粒子结构及其对宿主和宿主病原体的影响——在很大程度上仍停留在序列数据之外。例如，尽管蚊子的ISVs因其在媒介能力中的作用和在虫媒病毒控制中的潜在应用而被深入研究，但只有少数ISVs会干扰农业昆虫媒介对植物病毒的获取和传播。昆虫病毒研究的最终目标被认为是开发新型生物防治剂。然而，目前基础生物学知识的缺乏仍然是未来利用非杆状病毒ISVs的重大障碍。我们已经强调了ISVs多样化的潜在应用，包括它们表现严重致病性、干扰媒介能力、改变其他病原体毒力、作为雄性致死因子以及改变宿主行为生理的能力。尽管某些挑战可能阻碍基于ISV的生物农药的商品化，但非杆状病毒ISVs代表了潜在的生物农药的巨大宝库。这些病毒可能被纳入综合害虫管理策略，为农业害虫防治提供新颖且可持续的解决方案。此外，RNA干扰是一种环境友好的害虫防治策略，但双链RNA的高效递送仍然是一个主要挑战。病毒诱导的基因沉默提供了一种利用工程病毒载体递送双链RNA的新方法。因此，已发现的ISVs多样性可能为开发适合此目的的病毒载体提供宝贵资源。
