解读生命的蓝图：用于单细胞多组学和功能基因组学的综合技术协议

《Blood Science》：Deciphering the blueprint of life: integrated protocols for single-cell multi-omics and functional genomics

单细胞多组学技术推动造血系统研究标准化与机制解析，通过整合CRISPR筛选、多模态转录组表位分析、表达与可及性直接关联及scATAC-seq分析流程，解决数据异质性与技术标准化问题，助力疾病机制与靶向治疗研究。

单细胞技术的快速发展从根本上改变了我们探究细胞异质性和生物复杂性的能力，使我们能够以前所未有的分辨率进行观察。在过去的几年中，该领域已经从单纯创建描述性的“细胞图谱”发展到了一个新的前沿，重点在于对调控网络的功能验证和机制剖析。其中，启动并实施的“数十亿血细胞的造血生态系统多组学图谱”（HEMO ABC）项目尤为重要。该项目旨在全面而精确地描述大量血细胞，目标是构建一个包含血液系统中各种细胞类型特征及其相互关系的庞大数据库。然而，这样一个雄心勃勃的项目面临着诸多挑战：来自不同研究平台的数据具有异质性，这使得数据整合成为一项艰巨的任务；此外，缺乏统一且标准化的技术体系来确保研究的质量和一致性。因此，这种范式的转变对于高度动态和复杂的造血生态系统尤为重要。

造血系统是一个精细调控的层级结构，其中造血干细胞（HSCs）处于顶端，其稳态是通过基因扰动、表观遗传调控以及表型输出之间的复杂相互作用来维持的。¹为了全面理解这一生态系统如何保持平衡，或者相反地，如何导致白血病和骨髓纤维化等疾病状态，本特刊重点介绍了“单细胞多组学和功能基因组学技术”，并系统地介绍了四种前沿解决方案。这些方案旨在为研究人员提供一个全面的“工具箱”，以建立标准化和统一的技术体系，从而为深入理解血液系统提供坚实的技术支持。

1. 通过CRISPR筛选进行系统级解析

²虽然成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）筛选已成为功能基因组学中的变革性工具，²但传统的汇总方法往往受限于将细胞存活率作为主要评估指标。³这种评估方式将复杂的生物学影响简化为单一的生存率指标，未能捕捉到细胞身份和调控途径中的高维变化。⁴“利用单细胞CRISPR筛选解析细胞生态系统”这一协议探讨了如何将汇总筛选与单细胞组学技术（如Perturb-seq和CROP-seq）结合使用，从而在个体基因操作后进行全面分析。这一工作流程有望弥合基因扰动与系统级生物学解析之间的差距。

2. 转录组和表位的多模态解析

⁵鉴于仅依靠转录组数据往往无法完全捕捉细胞功能的复杂性（这主要是由于mRNA转录与蛋白质表达之间的脱钩，以及无法考虑对细胞表型和活性起关键调控作用的转录后和翻译后修饰），CITE-seq协议作为一种稳健、标准化的多模态单细胞技术应运而生，能够同时分析全长RNA转录组并定量分析细胞表面蛋白表位。⁵与传统方法不同，CITE-seq采用了抗体-寡核苷酸（Ab-oligo）结合的技术：每个针对特定细胞表面蛋白的单克隆抗体都与含有唯一条形码的寡核苷酸标签共价连接。这种设计能够同时捕获单个细胞中的多聚腺苷酸化mRNA分子和Ab-oligo标签，无需进行细胞分选或样本分割，同时保留了细胞的原始状态。这项技术改进显著提高了细胞类型分类的分辨率，使研究人员能够区分那些在转录组学上难以区分但在功能上不同的细胞亚群。特别是在免疫学和肿瘤学领域——在这些领域中，稀有细胞群体往往对疾病进展和治疗反应有重要影响——CITE-seq能够实现对稀有细胞亚群的精确、高通量分析。⁶⁷

3. 表达与可及性的直接关联

^8–10通常情况下，scRNA-seq和scATAC-seq的独立分析依赖于间接整合来推断调控关系，这限制了对机制的深入理解。本特刊提出的基于液滴的联合分析方法能够直接在同一细胞内同时测量基因表达和染色质可及性，从而解决了这一问题。这种可扩展且可重复的液滴技术可以并行分析数万个细胞，显著提高了细胞状态的解析能力，并能够检测到稀有或处于过渡状态的细胞群体。^8–10通过将转录输出与其表观遗传背景直接关联，这种方法为解析造血分化和疾病背后的调控机制提供了有力工具，是推动单细胞研究从描述性图谱向功能性和机制性理解迈出的关键一步。

4. 优化后的scATAC-seq计算流程

¹¹随着数据复杂性的增加，强大的分析流程变得至关重要。其中一个推荐的协议提供了一个先进的scATAC-seq分析流程，不仅包括基本的细胞聚类，还涵盖了深入的机制解析。该流程整合了关键步骤，如使用MACS2进行稳健的峰值检测¹¹，以及利用chromVAR推断转录因子（TF）活性¹²。值得注意的是，该协议强调通过Tn5偏差校正进行高分辨率的调控图谱绘制，并使用SCENIC+重建转录调控网络（TRNs）¹³。通过将增强子与目标基因（eRegulons）联系起来，这种综合方法为解码基因调控逻辑和识别驱动细胞身份的主要调控因子提供了有力工具。 ⁶总之，本特刊中介绍的实验策略共同构成了一个强大且可扩展的下一代单细胞研究框架。这些方法超越了单纯的描述性分析，实现了对基因功能和调控回路系统的系统化探究，标志着向更深入的机制性和可操作性理解迈出的重要一步。 ⁷在造血和血液系统疾病的背景下，这里介绍的标准化和可重复的工作流程为基础研究与转化应用之间的衔接提供了关键基础。随着单细胞技术与人工智能引导的实验设计以及空间分辨技术的结合，这些方法预计将在未来生物学的发现和创新治疗策略的开发中发挥核心作用。