《EMI: Animal & Environment》：Overwintering and vertical transmission of Usutu virus in Culex pipiens, biotype pipiens mosquitoes contribute to annual re-emergence
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本文实验证明，越冬（overwintering）状态下的淡色库蚊（Culex pipiens）可携带乌苏图病毒（USUV），并在春季条件恢复后重新激活病毒并高效传播。研究首次提供了淡色库蚊作为USUV越冬宿主及季节性重现关键环节的直接证据，证实了病毒垂直传播的可能，并揭示了病毒在越冬后蚊虫体内的进化动态。这对于深入理解欧洲蚊媒病毒持续循环机制具有重要意义。
材料与方法
本研究旨在探究乌苏图病毒（USUV）感染的越冬雌性淡色库蚊（Culex pipiens, biotype pipiens）在冬季后是否能携带并传播病毒。研究在荷兰瓦赫宁根大学的三级生物安全（BSL-3）实验室中进行。实验蚊虫来自2020年夏季在瓦赫宁根采集的卵筏，并通过qPCR鉴定为pipiens生物型。实验蚊虫分为三组：非越冬组、越冬组和越冬后组。
为诱导越冬，将F19子代的一龄幼虫置于短光照（8小时光照:16小时黑暗，8:16 L:D）和16°C的条件下培育。羽化后的成蚊在相同条件下（6°C， 8:16 L:D）饲养，以模拟冬季环境。为积累足够的脂肪储备，蚊虫在六周内可自由取食6%葡萄糖溶液，之后仅提供水。非越冬组蚊虫则在长光照（16:8 L:D）和23°C的标准条件下饲养。
所有实验组蚊虫均通过胸腔注射感染USUV（非洲谱系3）。在为期18周的实验期内，每隔四周（T1-T4）对蚊虫进行取样分析，检测其在虫体、腿部（代表病毒扩散dissemination）和唾液（代表传播能力transmission）中的病毒感染情况。越冬后组蚊虫在经历不同时长的6°C越冬处理（4、8、12、16周）后，被转移到春季条件（23°C， 16:8 L:D）下再孵育14天，然后进行检测。
此外，为了研究垂直传播，实验对感染USUV9天后的雌蚊提供鸡血餐，并收集其产下的卵筏，通过感染性测定和RT-PCR检测病毒存在。
结果
越冬与存活率
实验成功模拟了蚊虫的越冬状态，越冬组蚊虫存活率在感染后16周内保持稳定，平均约为70%。相比之下，非越冬组蚊虫的存活率持续下降，在感染后16周时已无存活个体。越冬后组蚊虫在转移至23°C后的14天内，未出现严重的存活率下降。
感染、扩散与传播效率
非越冬组蚊虫在整个实验期间的感染率始终为100%，扩散率在86%至100%之间，传播率在67%至100%之间，表明注射感染成功且病毒在蚊虫生命周期内持续存在。然而，在6°C越冬条件下的蚊虫，其虫体、腿部和唾液样本中的病毒滴度大多低于检测限，仅有极少数个体在特定时间点检测到病毒（T2: 3/118， T3: 2/113， T4: 1/108），且未检测到有效的病毒扩散或传播。
最为显著的结果出现在越冬后组。在经历6°C低温处理后，一旦蚊虫被置于春季条件（23°C）下14天，病毒迅速被重新激活。越冬后组蚊虫的虫体感染率达到了惊人的100%，扩散率也为100%，传播率高达92%至100%，且这一高效传播能力不受越冬期长短（4-16周）的影响。这表明，只要蚊虫在越冬前感染了病毒，它们就能够在春季条件到来时迅速成为高效的病毒传播者。
垂直传播
在垂直传播实验中，共对255只感染USUV的雌蚊进行了研究，其中136只产卵。通过感染性测定和RT-PCR确认，在136个卵筏中，有4个（2.9%）检测出USUV阳性，其循环阈值（Ct）值在21.29至28.09之间。这证实了USUV可以通过母蚊垂直传播给子代。
病毒进化
研究还对非越冬组和越冬后组蚊虫唾液样本中的病毒基因组进行了测序分析。在33个非越冬组样本中，有2个（6.1%）发现了共有序列突变。在46个越冬后组样本中，有7个（15.2%）发现了共有序列突变，但两者在统计学上无显著差异。然而，在分析次要变异体（minor variants）时发现，越冬后组唾液样本中出现了显著更多的次要变异体位点（共123个），而非越冬组仅有41个。统计分析表明，越冬后组蚊虫中出现多于一个变异体的情况，显著多于非越冬组。这暗示病毒在越冬后经历快速复制时，其RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）可能更容易产生复制错误，导致更多变异积累。
讨论
本研究为淡色库蚊作为USUV的越冬宿主，并驱动其季节性重现提供了关键的实验证据。最核心的发现是，在越冬期间处于休眠状态的病毒，能够在春季条件恢复后被高效重新激活，使得蚊虫具备极强的传播能力。这解释了为何在野外越冬蚊虫中很难直接检测到病毒（因为低温抑制了病毒复制），但病毒却能在来年重新出现。
此外，研究证实了USUV存在低频率的垂直传播（2.9%），这意味着雌蚊在进入越冬前就可能通过此途径获得病毒，为病毒的跨季节持续提供了另一条潜在途径。尽管频率不高，但在病毒生态学中具有重要意义。
关于病毒进化，越冬后蚊虫体内检测到更多的病毒基因组次要变异体，提示温度波动可能对病毒进化施加了选择压力，值得未来在更多样本中进行深入研究，并分析这些变异的功能意义。
最后，研究也对监测实践提出了建议。由于低温会抑制病毒复制，直接检测越冬蚊虫体内的病毒可能效率低下。未来的监测方案应考虑在检测前，将越冬蚊虫样本置于适宜温度下孵育一段时间，以“唤醒”潜在的病毒感染，从而提高检出率。除了蚊虫，候鸟、留鸟间的冬季传播以及蜱等其他媒介，也可能在USUV的越冬中扮演角色，需要综合考量。
综上所述，本研究通过实验证明，经历越冬的淡色库蚊是USUV有效的越冬宿主，其在春季条件恢复后的高效传播能力，以及存在的垂直传播途径，共同构成了该病毒在欧洲实现年度季节性重现的关键机制。
