《Future Science OA》：Targeting FMO3 suppresses the malignant phenotype of colorectal cancer: evidence from bioinformatics to functional experiments
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本研究聚焦于含黄素单加氧酶3（FMO3）在结直肠癌（CRC）中的促癌作用。研究发现FMO3在CRC中显著高表达，与不良预后相关。机制上，沉默FMO3可通过抑制PI3K/AKT信号通路、逆转上皮-间质转化（EMT）并诱导细胞周期G0/G1期阻滞，从而抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭。此外，FMO3表达与免疫细胞浸润和免疫检查点分子相关。该研究揭示了FMO3作为CRC潜在生物标志物和治疗靶点的重要价值。
引言背景：结直肠癌与代谢重编程
结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因。除了传统风险因素，越来越多的证据强调了肥胖、高脂饮食和肠道菌群失调在CRC发生发展中的关键作用。其中，肠道菌群衍生代谢物氧化三甲胺（TMAO）已成为连接饮食、肠道菌群和结直肠癌发生的关键介质。前瞻性研究表明，较高的循环TMAO水平与CRC风险增加相关。临床数据进一步显示，CRC患者体内的TMAO浓度升高。在机制上，TMAO可抑制自噬相关蛋白、激活NLRP3炎症小体、促进促炎表型，从而加剧肠道炎症和屏障功能障碍。在CRC模型中，TMAO还能通过上调血管内皮生长因子A（VEGFA）的表达和分泌，促进结直肠癌细胞增殖和增强血管生成。
在此背景下，含黄素单加氧酶3（FMO3）作为一种肝脏微粒体酶，是催化三甲胺（TMA）氧化为TMAO的关键酶，被认为是人体内循环TMAO的主要内源性来源。尽管在非小细胞肺癌等肿瘤中已有研究提示FMO3的促癌特性，但其在CRC中的具体作用模式、预后相关性、下游信号网络及其对肿瘤免疫微环境的影响尚未得到系统研究。本研究通过结合多组生物信息学分析和实验验证，旨在全面探究FMO3在CRC中的作用。
FMO3在结直肠癌中高表达并与不良预后相关
通过泛癌分析和结肠腺癌（COAD）队列数据分析发现，FMO3在包括胶质母细胞瘤（GBM）、低级别胶质瘤（LGG）、子宫内膜癌（UCEC）、结肠腺癌（COAD）、直肠腺癌（READ）、乳腺癌（BRCA）和肺腺癌（LUAD）在内的多种恶性肿瘤中显著上调，而在甲状腺癌（THCA）或胰腺癌（PAAD）中与正常组织相比无显著差异。在结肠腺癌中，肿瘤组织（n=287）的FMO3表达水平显著高于正常组织（n=41）。来自癌症基因组图谱（TCGA）的结直肠癌数据分析也证实了FMO3在COAD中的表达显著升高。生存分析显示，在TCGA和GEO（GSE39582）队列中，高表达FMO3与患者较差的总生存期显著相关。实验验证进一步表明，与人正常结肠上皮细胞NCM460相比，FMO3蛋白在COAD细胞系HCT116和HT29中表达显著升高。基因集富集分析（GSEA）表明，FMO3高表达富集于Toll样受体信号、T细胞受体信号、JAK-STAT和MAPK信号通路，以及与结直肠癌相关的通路。
组织微阵列分析显示，与配对的癌旁非肿瘤组织相比，FMO3在结直肠癌组织中的表达显著上调。定量评估进一步证明，FMO3高表达与更晚期的病理分级显著相关。免疫组化验证也证实了FMO3蛋白在结直肠癌组织中的稳健上调。
FMO3相关基因的相互作用网络与功能富集
对FMO3相互作用和表达相关基因的综合分析揭示了其与癌症和免疫相关通路的紧密联系。共鉴定出2088个与FMO3共表达的基因，这些基因在免疫和癌症相关通路中显著富集。在31个高度富集的通路（富集因子>2）中，有20个与肿瘤相关，包括PI3K-AKT、MAPK、细胞因子-受体相互作用、细胞粘附分子（CAMs）和PD-1/PD-L1检查点信号通路。对肿瘤相关基因的整合分析得到了166个候选基因，进一步通过STRING-CytoNCA分析鉴定出10个枢纽基因：PIK3R1、ITGB1、TLR4、HRAS、CD4、CXCL10、CD8A、ITGAL、CCL2、ITK。FMO3相互作用模块与FMO3相关表达模块存在39个重叠基因。这些枢纽基因之间在结直肠癌中表现出高度的相互关联性。对枢纽基因的功能富集分析表明，它们参与免疫激活通路（如细胞因子/T细胞受体信号）和促侵袭程序（如粘附/MAPK激活）。GSCALite分析显示，关键的枢纽基因（如HRAS, PIK3R1, ITGB1）可激活PI3K-AKT和RAS-MAPK通路，同时抑制凋亡和DNA修复信号。免疫相关的枢纽基因（如CD8A, CXCL10）也与TSC-mTOR代谢调控相关，提示了CRC中免疫逃避与代谢重编程之间存在相互作用。
FMO3表达与免疫细胞浸润及免疫检查点的相关性
全面的免疫谱分析显示，FMO3表达与24个免疫细胞亚群显著相关。具体而言，FMO3与巨噬细胞、未成熟树突状细胞（iDCs）、树突状细胞（DCs）和辅助性T细胞1（Th1）呈正相关，而与辅助性T细胞17（Th17）和自然杀伤细胞CD56明亮亚群（NK CD56bright cells）呈负相关。高表达FMO3组与低表达组相比，FMO3显著改变了23种免疫细胞类型的浸润情况，高表达倾向于Th1/细胞毒性免疫特征，而低表达则指示免疫抑制表型。此外，FMO3表达与免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分呈正相关。FMO3还与多种免疫检查点基因呈强正相关，包括PD-L1、LAG3、TNF和IFN-γ。
FMO3在结直肠癌细胞中的功能验证：抑制恶性表型
为了探究FMO3的生物学功能，研究团队通过慢病毒shRNA转导，在HCT116和HT29结直肠癌细胞中构建了稳定的FMO3敲低模型。蛋白质印迹法（Western blot）证实了FMO3的有效抑制。
在功能层面，FMO3敲低显著抑制了结直肠癌细胞的转移表型。划痕愈合实验和Transwell实验表明，FMO3敲低显著降低了HCT116和HT29细胞在24小时和48小时的迁移能力，并在72小时内显著抑制了细胞侵袭。为了阐明潜在机制，研究检测了上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的表达。FMO3沉默导致间质标志物（波形蛋白Vimentin、N-钙粘蛋白N-cadherin）和基质金属蛋白酶2/9（MMP2/MMP9）表达下降，同时伴随着两种细胞系中E-钙粘蛋白（E-cadherin）表达的显著增加。此外，FMO3敲低减弱了PI3K-AKT通路活性，表现为磷酸化的PI3K（p-PI3K）和磷酸化的AKT（p-AKT）减少，而总PI3K和AKT水平保持稳定。这些信号变化与观察到的EMT抑制现象一致。
FMO3敲低诱导细胞周期阻滞并抑制克隆形成
细胞周期分析显示，FMO3敲低在HCT116和HT29细胞中均诱导了明显的G0/G1期阻滞，并伴随着S期细胞群的显著减少。相应地，关键的G1/S期转换调节因子细胞周期蛋白依赖性激酶4和6（CDK4和CDK6）的表达在FMO3沉默后显著下调。在功能上，克隆形成实验表明，FMO3敲除严重损害了克隆形成生长能力，使HCT116细胞的集落数量分别减少了52.5%（sh#2）和78.1%（sh#3），HT29细胞的集落数量分别减少了68.34%（sh#2）和84.70%（sh#3）。敲低细胞形成的集落也更小，表明其增殖潜力下降。在分子水平上，FMO3敲低诱导了P21和P53的上调，同时伴随Bax表达增加和Bcl-2表达减少。
结论与展望
本研究表明，FMO3在结直肠癌中显著过表达，并通过促进上皮-间质转化、激活PI3K/AKT信号通路和破坏细胞周期调控来驱动恶性进展。沉默FMO3可抑制细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成，同时诱导G0/G1期阻滞和促凋亡通路。此外，FMO3还能塑造一个具有免疫调节功能的肿瘤微环境，提示其可能在免疫逃逸中发挥作用。这些发现确立了FMO3作为结直肠癌一个有前景的生物标志物和治疗靶点。尽管本研究存在样本量相对有限、缺乏治疗反应和长期随访数据等局限性，但未来结合体内模型和多组学方法的研究，将有助于进一步阐明FMO3-TMAO轴在CRC进展中的功能作用和分子机制。
