《GM Crops & Food》：Simple, fast, reliable: multiplex digital PCR quantification of 19 genetically modified soybean events
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随着新转基因作物品种不断进入市场，高通量、多靶点分析方法对转基因检测与定量以满足监管合规需求变得日益重要。本综述介绍的是一种基于纳米孔板“一体化”数字PCR系统的多重dPCR方法，可一次性对19种转基因大豆品系及内参基因进行区分定量。该方法将19个靶点整合为4个五重检测体系，利用平台的多重荧光检测通道优势，在特异性、正确性、精密度、灵敏度和动态范围方面均满足最低性能要求，简化了工作流程，无需预先筛查，是目前最全面的多靶点转基因大豆定量方案，有望在监管监测和常规检测中广泛应用。
转基因作物的定量检测是保障食品安全、满足法规遵从性的重要环节。随着市场上转基因作物品种的不断增加，开发高通量、多靶点的检测与定量方法至关重要。定量聚合酶链式反应是目前的“金标准”，但其多重检测能力有限，且依赖于标准曲线，在面对大量靶点同时检测时，其成本和时间效率受限。而数字PCR技术通过将反应体系分割成数千个微小反应单元，可实现核酸的绝对定量，无需标准曲线，对PCR抑制剂的耐受性更强，并且更易于实现多重检测。这些优势使其成为转基因作物定量，特别是多重定量分析的理想选择。
材料与方法
2.1. 测试材料
研究使用了来自美国油化学家学会和欧盟联合研究中心的转基因大豆认证参考物质。这些CRM涵盖了当时欧盟授权的17种转基因大豆品系、一种授权已过期的品系以及一种待批准品系。DNA提取主要采用CTAB法，并使用商业试剂盒进行辅助提取，提取后的DNA用含有小牛胸腺DNA的水进行稀释以用于后续实验。
2.3. 生物信息学特异性与引物/探针相互作用预测
在实验前，利用MFEPrimer和Autodimer软件对所有设计的四重检测组合进行了生物信息学分析，评估了引物在包括大豆、玉米、油菜、水稻和小麦在内的多种作物基因组中的潜在非特异性扩增风险，以及引物和探针之间形成二聚体的可能性，以确保检测的特异性。
2.4. 基于QIAcuity平台的数字PCR
实验在一体化的QIAcuity One数字PCR系统上进行，使用QIAcuity纳米孔板和Probe PCR试剂盒。反应体系包含PCR预混液、引物-探针混合物、水以及DNA样本。PCR循环条件包括95°C 2分钟，随后进行40个循环的95°C 15秒和60°C 30秒。荧光信号在QIAcuity软件套件中进行分析，通过手动设置荧光阈值来区分阳性和阴性分区，最终计算目标基因拷贝数与内参基因的比值，并结合转换因子得出转基因百分比。
结果
3.1. 检测设计
研究将已有的欧盟标准事件特异性检测方法整合为四个五重检测。其中，5-plex 1检测DBN-09004–6、GMB151、SYHT0H2、MON87751和；5-plex 2检测305423、BPS-CV127-9、MON87769、MON87701和MON87708；5-plex 3检测40–3-2、A5547-127、A2704-12、MON89788和MON87705；5-plex 4检测FG72、DAS-68416–4、356043、DAS-81419–2和DAS-44406–6。这种设计最大限度地利用了已有的特异性验证数据，并覆盖了当时在欧盟相关的重要大豆转基因事件。
3.2. 特异性
生物信息学分析未预测到显著的非特异性扩增。体外特异性测试表明，5-plex 2、3、4在非靶标大豆事件和非大豆转基因事件混合物中均无非特异性扩增。5-plex 1在检测含有5-plex 4靶标事件的复杂混合物时，在对应于DBN-09004–6的绿色通道中观察到了少量荧光信号介于阴性与阳性分区之间的分区。进一步实验确定，事件DAS-68416–4和356043的存在是导致此现象的主要原因。由于真实的阳性分区信号与这些中间信号有良好的区分度，通过适当设置荧光阈值，可以准确量化目标，不影响检测特异性。因此，所有检测方法均具备足够的特异性。
3.3. 单重与多重检测比较
通过对单一转基因事件的DNA进行检测，将四个五重检测的结果与对应的单重检测进行了比较。结果显示，所有事件在多重和单重检测间的偏差均小于25%，证明了多重检测与单重检测具有良好的一致性，适用于后续实验。
3.4. 正确性
利用多重数字PCR实验数据计算各CRM的转基因百分比，并与CRM的指定值进行比较。结果表明，所有测试事件的偏差均小于25%，符合欧洲转基因生物参考实验室网络制定的转基因分析方法性能指南的要求，验证了方法的准确性。
3.5. 动态范围与线性
通过测试一系列稀释的DNA混合物，确定了每个转基因靶标事件的动态范围。结果显示，所有靶向的转基因事件在每反应40到2520拷贝的范围内均表现出良好的定量能力，符合相关指南要求。线性回归分析表明，所有检测在该动态范围内均具有良好的线性，R2> 0.99。
3.6. 灵敏度与精密度
在目标浓度近似相等的条件下，测定了各靶标的检测限和定量限。转基因大豆事件的定量限在27-36拷贝/反应之间，检测限在13-19拷贝/反应之间。内参基因的检测限为8拷贝/反应，定量限为39拷贝/反应。此外，在“非对称条件”下测试了各事件，即在含有高拷贝数背景其他靶标的情况下，测定低拷贝数目标事件的LOD和LOQ。结果显示，所有事件的非对称定量限均低于50拷贝/反应，检测限在5-16拷贝/反应之间，均满足指南规定的每反应低于25拷贝的要求，表明该方法在复杂样品基质中仍能保持高灵敏度。
3.7. 稳健性
通过轻微改变退火/延伸温度（±1°C）以及引物探针浓度（±10%），测试了方法的稳健性。在所有测试条件下，各靶标的变异系数均未超过25%。仅在SYHT0H2事件的一个测试条件下，当温度降低1°C时，偏差超过了30%，但这可能源于重复数较少。总体而言，该方法在实验条件发生微小波动时仍能保持稳定，具备良好的稳健性。
3.8. 应用适用性
通过分析一个能力验证样品和三个常规诊断样品，评估了方法的实际应用价值。能力验证样品中，该方法定量的事件BPS-CV127-9的结果与指定值偏差为-5.9%。在三个常规诊断样品中，多重dPCR检测到的事件与之前qPCR或单重dPCR检测结果一致，且对可定量事件的偏差绝大部分在可接受的25%以内，证明了该方法在真实世界样本分析中的可靠性。
讨论
本研究展示了一种基于多重数字PCR的高效、高性价比的检测方案，能够对19种转基因大豆品系及内参基因进行区分定量。相较于以往的研究，该方法在可区分定量的靶点数量上实现了显著提升，涵盖了当时欧盟市场相关的几乎所有大豆转基因事件。所采用的纳米孔板一体化dPCR平台，将样品分区、温度循环和荧光检测集成于一台设备，自动化程度高，极大地简化了工作流程，减少了手动操作时间和对操作人员的特殊培训要求。
本研究为开发高通量、多重dPCR转基因作物定量检测方法树立了典范，证明了利用少量多重反应即可对某一物种的所有转基因事件进行全面定量的可行性。这一思路未来可扩展至其他作物，从而在提高分析能力的同时，显著降低常规转基因诊断的分析成本，改善食品和饲料的可追溯性及法规遵从性，并为消费者和生产者提供更丰富的信息。该方法甚至可能使初步筛查步骤在某些情况下不再必要。
特异性是多重检测开发的关键。本研究通过生物信息学和广泛的体外测试，确保了检测的特异性。虽然在一个检测中观察到了低水平的非特异性荧光信号，但通过合理设置阈值即可有效规避，不影响准确定量。
随着新技术和新型转基因事件的出现，该方法具有良好的可扩展性。例如，新出现的MON-94313–8事件可通过将其单重检测与现有的四个五重检测并行运行来纳入。同时，检测平台的软件更新已支持更多荧光通道，未来可将五重检测升级为六重甚至八重检测，进一步整合新靶点。
数字PCR存在“死体积”问题，即未参与分析的液体部分，这带来了方法性能评估标准上的模糊性。本研究选择以“每分析体积的拷贝数”作为评估基准，使得方法性能在不同平台间更具可比性。对于极低浓度的样本，可通过增加起始物料、提高DNA提取效率、加大反应中DNA样本的加入量或使用更高通量的纳米孔板等方式来满足灵敏度要求。总体而言，该方法具备出色的性能，并能根据实际需求进行灵活调整。
综上所述，本研究建立的针对19种转基因大豆事件的多重dPCR定量方法，为诊断实验室大幅减少定量分析所需反应数量提供了可能。该方法流程简化、性能可靠，易于适应其他平台，其开发策略也为其他转基因作物的类似检测方法开发提供了宝贵借鉴，有望推动转基因食品和饲料样品的全面、高效定量分析进入新阶段。
