《Gut Microbes》：Invasion of gut-derived escherichia coli extracellular vesicles exacerbates myocardial ischemia/reperfusion injury
编辑推荐：
本研究首次系统揭示了心肌缺血再灌注损伤后，肠道菌群紊乱导致大肠杆菌胞外囊泡（EVs）穿过受损肠黏膜屏障进入循环和心脏，其作为脂多糖（LPS）的关键载体，通过招募并极化身循环与局部炎症细胞（特别是促炎性Ly6Chigh单核细胞/巨噬细胞），加剧心肌损伤与功能恶化。研究创新性地发现胰高血糖素样肽-2（GLP-2）可通过增强肠屏障功能，有效抑制EVs易位，从而减轻炎症、改善心脏修复，为“肠-心轴”理论提供了新依据，并提出了心血管疾病治疗新策略。
引言
急性心肌梗死（Acute myocardial infarction）仍是人类健康的主要威胁。尽管急诊冠状动脉介入等医疗技术进步显著改善了患者生存率，但缺血/再灌注（I/R）损伤持续对患者术后生存和生活质量产生不利影响。全身和局部炎症细胞的动员与浸润与心肌损伤和修复密切相关，然而过度的炎症反应会损害心脏功能恢复。近年来，肠道菌群在健康和疾病易感性中的作用日益凸显。除了其代谢产物，细菌分泌的胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是另一类重要介质。这些纳米级的细菌囊泡可参与多种生理病理过程。本研究旨在探究肠道菌源EVs在心肌I/R损伤病理生理过程中的作用，特别是它们在I/R损伤后炎症微环境中的作用及其对此病理状态的贡献。
结果
1. 心肌I/R损伤后的肠道菌群改变与大肠杆菌EVs表征
为了研究心肌I/R损伤后小鼠的肠道菌群失调，我们分析了之前本课题组对I/R损伤模型手术后3天小鼠结肠内容物进行的16S核糖体RNA基因测序结果。在属水平，I/R损伤后大肠杆菌（Escherichia）的比例显著增加，而被公认的益生菌乳杆菌（Lactobacillus）的比例显著下降。鉴于大肠杆菌相对较高的比例及其在I/R损伤后丰度的增加，我们选择大肠杆菌作为后续研究的焦点，以探究大肠杆菌EVs对心肌损伤修复的影响。
我们采用密度梯度超速离心法分离了大肠杆菌EVs，并对其表型和形态特征进行了表征。透射电子显微镜成像显示EVs具有双层膜结构。纳米颗粒跟踪分析表明大肠杆菌EVs的平均粒径约为200 nm。对分离的大肠杆菌EVs进行蛋白质组学分析，显示外膜蛋白OmpC和OmpA大量表达。蛋白质印迹分析进一步证实了OmpC和OmpA在大肠杆菌EVs中的存在。最后，使用基于流式细胞术的珠结合EVs蛋白标记方案，我们验证了OmpA在大肠杆菌EVs表面的表达。作为阴性对照，我们培养了成熟的益生菌植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum, L. plantarum），分离其EVs，并通过电镜、粒径分析和蛋白质组学进行了表征。
2. 心肌I/R损伤后的肠道屏障破坏与大肠杆菌EVs易位
我们假设大肠杆菌EVs可以穿过肠黏膜屏障进入血液。为了验证这一点，我们首先检查了I/R损伤建模后小鼠肠道黏膜屏障是否发生改变。术后第3天，对肠道进行免疫荧光染色和蛋白质印迹分析。结果显示，与假手术组相比，Claudin-1和Occludin的表达显著降低，这些是维持肠上皮屏障的关键紧密连接蛋白。我们还通过灌胃给予小鼠FITC-葡聚糖，发现心肌缺血再灌注手术后小鼠血清中的荧光强度显著增加。此外，观察到机械屏障损伤，改良的Chiu's评分显著增加。这些发现进一步证明了肠黏膜屏障的破坏。
为了确定细菌胞外囊泡是否能穿过肠黏膜屏障，我们参考相关研究，利用表达Cre重组酶的大肠杆菌与Rosa26.tdTomato报告小鼠结合，以可视化大肠杆菌EVs向外周血和心脏组织的转移。当这些EVs进入小鼠细胞时，Cre-LoxP系统诱导受体细胞中tdTomato红色荧光蛋白的表达。我们首先使用抗生素混合物清除Rosa26.tdTomato报告小鼠的内源性肠道菌群，然后通过口服灌胃在肠道中定植表达Cre的大肠杆菌。表达绿色荧光蛋白的工程化大肠杆菌作为对照。在定植表达Cre的大肠杆菌后，小鼠接受I/R手术，在心脏组织中检测到tdTomato红色荧光。相比之下，在定植表达GFP的大肠杆菌的小鼠中未检测到GFP荧光，这表明tdTomato红色荧光源于表达Cre的大肠杆菌EVs的易位，而非细菌本身的易位。考虑到EVs可被巨噬细胞吞噬，我们对心脏组织进行了CD68染色，确实观察到了CD68和tdTomato的共定位信号。外周血的流式细胞术分析进一步支持了这些发现，显示I/R损伤后血液中表达tdTomato红色荧光的细胞数量增加。这些结果证明，在心肌I/R损伤后，更多的细菌EVs进入外周循环和心脏组织。
3. 细菌EVs介导的心肌I/R损伤中LPS易位
除了OmpC和OmpA等膜蛋白标记物外，大肠杆菌来源的EVs还含有包括脂多糖在内的致病因子，以及LPS组装相关蛋白如LptD和LptE，这些在对照的植物乳杆菌EVs中不存在。虽然大量研究表明心肌梗死患者循环LPS水平升高主要源于肠道细菌易位，但我们的发现揭示细菌EVs易位也是血液中细菌负荷增加的关键因素。这表明LPS等生物标志物的变化不能仅仅归因于完整细菌的易位。
为了进一步验证这一发现，我们在建立小鼠I/R模型一天后收集了外周血样本。通过超速离心分离EVs，并使用珠结合流式分析法分析OmpA表达。与心肌I/R损伤后循环中大肠杆菌来源EVs水平升高一致，我们发现OmpA+EVs与循环LPS浓度之间存在显著相关性。除了小鼠研究，我们还招募了健康对照者和ST段抬高型心肌梗死患者，在心肌梗死急性期收集外周血样本。由于人外周血量远大于小鼠，导致EVs产量显著更高，珠结合流式分析法检测到的OmpA阳性率过高。因此，我们转而检测了人外周血样本中EVs的另一个标记蛋白OmpC。我们的结果显示，与健康对照相比，STEMI患者中OmpC+EVs的水平显著升高。重要的是，与我们的动物研究一致，我们观察到人外周血中细菌EVs的丰度与循环LPS水平之间存在强相关性，这表明在STEMI期间，细菌EVs是LPS易位进入血液的载体。此外，我们发现OmpC+EVs的比例与已确立的心肌损伤标志物，包括肌红蛋白（Myo）和高敏心肌肌钙蛋白T（cTnT）呈显著正相关。这些发现共同表明，心肌缺血性坏死的程度直接影响含LPS的细菌EVs向循环中易位的程度。
4. 大肠杆菌EVs对单核细胞/巨噬细胞募集和极化的影响
鉴于大肠杆菌EVs含有LPS等病原体相关分子模式，大肠杆菌EVs进入循环和心脏组织预计会影响全身和局部炎症反应。为了研究这一点，我们首先通过流式细胞术分析了接受混合抗生素处理的小鼠外周循环和心脏组织中中性粒细胞的数量。这些小鼠经历了心肌梗死和随后的I/R损伤，然后通过口服灌胃接受大肠杆菌EVs或植物乳杆菌EVs处理。I/R损伤后3天，我们观察到与对照组和植物乳杆菌EV处理组相比，大肠杆菌EV处理组的中性粒细胞显著增加。在单核细胞/巨噬细胞方面，大肠杆菌EVs显著促进了促炎性Ly6Chigh表型，表明外周血和心脏组织中单核细胞/巨噬细胞的促炎极化增加。心脏组织巨噬细胞标记物CD68的免疫荧光染色、显示炎性细胞浸润的HE染色，以及测量外周血IL-1β、IL-6和TNF-α水平的ELISA检测进一步证实，穿过肠黏膜屏障的大肠杆菌EVs显著促进了全身和局部心脏炎症，而植物乳杆菌EVs则没有这种效应。
鉴于脾脏是单核细胞的储存库，且心肌I/R损伤可动员脾脏巨噬细胞，我们也评估了脾脏内单核细胞/巨噬细胞的变化。我们发现，口服大肠杆菌EVs后，脾脏中单核细胞/巨噬细胞数量减少，而巨噬细胞动员显著增加。随后，我们以RAW264.7细胞系为模型进行了体外实验。用大肠杆菌EVs或植物乳杆菌EVs处理细胞。结果显示，大肠杆菌EVs以剂量依赖的方式显著影响RAW264.7细胞的分化。iNOS的免疫荧光染色进一步证实大肠杆菌EVs促进单核细胞/巨噬细胞向促炎表型极化。为了进一步阐明促炎反应的增强是否与LPS相关，我们使用来自干酪乳杆菌和脆弱拟杆菌的EVs进行了额外的体外实验。我们发现结果与我们之前的发现一致：从脆弱拟杆菌（一种含有LPS的细菌）分离的EVs表现出更显著的促炎作用。大量研究已证实LPS可通过Toll样受体4（TLR4）调节全身炎症反应。我们尝试用HEK-Blue? mTLR4细胞验证大肠杆菌EVs对TLR4的影响。我们的结果表明，大肠杆菌EVs可有效激活TLR4信号通路。此外，与对巨噬细胞极化的影响类似，TLR4信号通路的激活强度随EVs浓度的增加而增加。
总之，这些发现表明，穿过肠黏膜屏障的大肠杆菌EVs促进了炎症细胞向全身和心脏组织的募集，增强了脾脏单核细胞/巨噬细胞的动员，并驱动了单核细胞/巨噬细胞的促炎极化。
5. 大肠杆菌EVs加剧I/R损伤后的心功能障碍和纤维化
研究结果表明，大肠杆菌EVs显著加剧了心肌I/R损伤后的炎症反应。过度炎症对心肌梗死患者的心功能、纤维化和预后产生不利影响。为了进一步研究穿过肠黏膜屏障的大肠杆菌 EVs是否直接导致更严重的心脏损伤，我们分析了其在接受口服大肠杆菌EVs的混合抗生素处理小鼠中的影响。I/R手术后，与对照组相比，大肠杆菌EV处理组的心功能显示出显著受损。这种损害归因于早期损伤阶段炎症浸润加剧，导致恢复阶段（特别是术后2-4周）心功能持续降低，与对照组和植物乳杆菌EV处理组相比。
伊文思蓝和2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色显示，尽管缺血区域相似，但与未处理组相比，大肠杆菌EV处理组的梗死面积显著更大。此外，肺湿/干重比和心脏重量/胫骨长度比的差异表明，大肠杆菌EV处理组的心脏肥厚更严重，肺水肿也更明显。麦胚凝集素染色进一步证实了心肌细胞增大。
心脏组织的马松三色和天狼星红染色显示，大肠杆菌EV处理组的纤维化和胶原沉积更明显，这与观察到的心功能恶化相关。这些发现共同表明，大肠杆菌EVs促进全身和局部炎症细胞动员和浸润，导致心功能受损和纤维化加剧。大肠杆菌EVs的存在与心脏损伤的严重程度密切相关。
6. GLP-2介导的抑制EVs易位减轻炎症并改善心脏修复
我们的研究结果表明，心脏损伤后肠道菌群组成发生显著改变，其特征是大肠杆菌比例增加。值得注意的是，大肠杆菌EVs可以突破肠黏膜屏障，影响心脏修复过程中的炎症反应。虽然先前关于肠道菌群的研究主要集中在微生物本身及其代谢物，但细菌EVs作为潜在治疗靶点受到的关注相对较少。作为肠-心-菌群-免疫轴的关键组成部分，大肠杆菌EVs在疾病进展和恢复中起着关键作用。然而，开发针对大肠杆菌EVs的有效干预措施仍然是临床转化的重大挑战。
在此背景下，我们将注意力转向胰高血糖素样肽-2（Glucagon-like peptide 2, GLP-2），这是一种与GLP-1在远端小肠和结肠黏膜的肠内分泌L细胞中共表达的33个氨基酸的肽。新兴证据表明，GLP-2可增强肠道屏障完整性并提供黏膜保护。认识到直接靶向细菌EVs的挑战，我们旨在研究GLP-2是否可以通过加强心肌I/R损伤后的肠道屏障来减轻大肠杆菌EVs的易位，从而缓解其对心脏修复的有害影响。GLP-1和GLP-2可能对血管功能有直接影响。为了排除这种潜在的干扰，我们在混合抗生素处理的小鼠中建立了心脏I/R模型并给予GLP-2治疗。结果显示，在混合抗生素处理的小鼠中，GLP-2不直接影响心脏损伤后的心功能或心脏血管生成。
接下来，我们在Rosa26.tdTomato报告小鼠的肠道中定植了表达Cre的大肠杆菌，并建立了I/R损伤模型。I/R损伤后立即皮下注射600 μg/kg的抗降解GLP-2类似物，随后连续给药三天。给药方案基于先前的相关研究。正如假设，心脏组织的荧光染色和外周血细胞的流式细胞术分析显示tdTomato+细胞显著减少，表明大肠杆菌EVs的易位被有效抑制。此外，我们证实GLP-2干预改善了肠道机械屏障完整性，并增加了紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin的表达。FITC-葡聚糖灌胃试验和对I/R损伤后野生型小鼠外周血分离的EVs中OmpA的流式细胞术分析显示了一致的结果：GLP-2干预降低了肠道通透性，保持了肠道屏障完整性，并有效抑制了细菌EVs易位。
我们随后研究了GLP-2介导的抑制细菌EVs易位对炎症和心功能的影响。我们使用流式细胞术分析了口服大肠杆菌EVs的混合抗生素处理小鼠的髓系细胞数量和亚型，无论是否接受GLP-2治疗。我们的分析显示，GLP-2治疗显著降低了I/R损伤后3天外周循环和心脏组织中Ly6Chigh单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞的比例。此外，对单核细胞/巨噬细胞储存库脾脏的流式细胞术分析表明，在GLP-2治疗和抑制EVs易位后，全身单核细胞/巨噬细胞的动员也显著减弱。其他评估，包括心脏组织单核细胞/巨噬细胞（CD68）的免疫荧光染色、外周促炎细胞因子的测量以及炎性细胞浸润的分析，进一步证实了GLP-2在减轻全身炎症反应和减少由肠道来源PAMPs触发的局部单核细胞/巨噬细胞浸润方面的作用。
我们接下来研究了GLP-2治疗是否可以缓解I/R损伤后由大肠杆菌EVs诱发的心功能障碍。在I/R损伤的急性期，GLP-2治疗通过调节炎症反应显著减小了梗死面积并保留了缺血心肌组织。超声心动图评估显示，GLP-2干预在慢性修复期改善了射血分数值。I/R手术后四周，GLP-2治疗显著减轻了心脏纤维化，表明GLP-2不仅在急性期增强了心功能，而且支持了长期的心脏组织修复。总之，这些发现强调了GLP-2通过抑制大肠杆菌EVs的易位来减轻I/R损伤期间的促炎反应，从而促进心功能的持续改善。
讨论
本研究首次以大肠杆菌为主要研究对象，证实了心肌I/R损伤后产生的细菌EVs可以穿过肠黏膜屏障，进入外周循环和心脏组织。此外，大肠杆菌EVs与循环LPS水平呈显著相关。因此，携带PAMPs的EVs迁移加剧了主要由单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞介导的先天免疫反应，从而加重了心肌损伤并损害了心功能恢复。值得注意的是，靶向肠黏膜屏障的GLP-2治疗有效抑制了EVs易位，调节了急性期炎症反应，并促进了组织修复。这些发现为心肌I/R损伤后的免疫调节提供了新的见解和策略。
近年来，“肠-心轴”概念在探索心血管疾病与肠道微生物组关系的研究中受到越来越多的关注。在包括心肌梗死、心房颤动和高血压在内的多种心血管疾病中，均已发现肠道菌群的改变。值得注意的是，几项关于心肌梗死患者的研究表明，肠道菌群变化、心功能和全身炎症反应之间存在强关联。“肠-心轴”的研究大致可分为两个主要方向。第一个方向关注肠道菌群衍生代谢物的影响，例如短链脂肪酸和氧化三甲胺，它们已被证明在心脏损伤和修复中发挥重要作用。第二个方向集中在细菌易位和有害成分（如代谢毒素和PAMPs）穿过受损的肠黏膜屏障并影响心脏修复的效应。肠黏膜屏障的损伤与多种因素有关，包括菌群失调、肠道缺血、水肿和肠道蠕动减少，所有这些都会增加肠道通透性。在这些条件下，外源性PAMPs，如来自革兰氏阴性菌的LPS，可以在循环中被检测到。主流假说将这一现象归因于细菌入侵或易位，因为一些研究观察到肠道来源的细菌迁移到血液和其他器官。
然而，细菌产物不仅限于各种肠道衍生代谢物。类似于真核细胞分泌EVs，细菌也产生EVs。肠道细菌来源的EVs可以直接与肠上皮细胞相互作用，影响自噬和免疫调节等过程。由于其纳米尺寸，与完整细菌相比，细菌EVs可以更容易地穿过肠黏膜屏障。此外，EVs具有在体内远距离部位发挥作用的能力。研究表明，细菌EVs在肠脑通讯中起着关键作用，因为它们可以穿过血脑屏障并在脑组织中积累，导致抑郁症、阿尔茨海默病和动脉粥样硬化等疾病。尽管有上述研究进展，但细菌EVs在心肌梗死等急性病症中的作用仍未探索，这使我们在理解它们在此类疾病中的潜在功能方面存在重大空白。本研究旨在调查细菌EVs的易位，并确定它们是否是LPS进入循环的载体。根据我们先前的研究，大肠杆菌被认为是肠道菌群的重要成员，丰度较高。此外，急性心肌梗死患者中大肠杆菌的丰度也显示出显著增加。因此，它是本研究的理想模型。同时，被公认为益生菌的乳杆菌被选为阴性对照。据报道，肠道乳酸菌菌落通过调节动脉粥样硬化炎症反应、胆固醇代谢和氧化应激对心脏发挥保护作用。具体来说，先前的研究表明植物乳杆菌对小鼠没有有害影响，进一步支持了其在本研究中作为对照的适用性。本研究随后的蛋白质组学分析证实了LPS和其他PAMPs在大肠杆菌EVs中的存在。虽然我们无法确定通过EVs转移的LPS相对于总LPS库的比例，但我们观察到大肠杆菌EVs与循环LPS水平之间存在强相关性，这表明它们在心肌梗死后LPS易位中起着关键作用。此外，由于EVs固有的免疫逃逸能力，来自EVs的LPS可能对宿主产生更深远的影响——我们将在后续研究中进一步阐明这些发现。
鉴于细菌EVs携带包括LPS在内的多种PAMPs，它们不可避免地会调节多种免疫细胞群。作为革兰氏阴性菌的主要致病因子，LPS通过与模式识别受体TLR4相互作用促进炎症，影响中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和T细胞。我们的体外实验也证实大肠杆菌EVs可以激活TLR4信号通路。大量研究已证明，随后的LPS-TLR4信号转导通过MyD88依赖性和非依赖性途径介导细胞内信号级联。单核细胞/巨噬细胞作为关键的先天免疫细胞，在心肌梗死的早期阶段迅速浸润缺血心肌，转变为促炎表型。肠道来源的EVs加剧并加速了这一炎症过程，导致炎症细胞因子过度分泌。我们的研究证实，大肠杆菌EVs增强了单核细胞/巨噬细胞从脾脏的动员、它们向心脏组织的浸润以及它们向促炎表型的转变，驱动了各种促炎细胞因子的产生。心肌梗死和再灌注后心脏的有效修复不仅需要及时启动炎症以清除坏死细胞和组织，还需要及时消退炎症反应。大量研究，包括我们团队的研究，已证明心肌I/R损伤后单核细胞/巨噬细胞的促炎表型与左心室功能和重塑密切相关。适当调节促炎和抗炎表型之间的转换对于心脏损伤后的组织修复至关重要。心肌损伤急性期过度炎症不可避免地会加重心脏损伤。在大肠杆菌EV组中，我们观察到更大的梗死面积、过度的心肌纤维化和更差的心功能，这与不受控制的炎症反应的有害影响一致。当然，除了LPS，EVs还携带许多其他外源性分子。将毒力因子传递给宿主细胞是细菌EVs最重要的功能，它们运输的不仅仅是LPS。例如，幽门螺杆菌产生的空泡细胞毒素A可以通过EVs持续释放，以诱发轻度胃炎，为幽门螺杆菌在宿主中的持续生存创造条件。来自铜绿假单胞菌的EVs含有由鞭毛蛋白、LPS和其他蛋白质组成的复合实体，可诱导宿主细胞的炎症反应。
