重塑肠道菌群-免疫互作：PD-1阻断通过MyD88/IgA-丁酸-PI3Kγ/IL-10通路减轻肠缺血再灌注损伤

《Gut Microbes》：PD-1 blockade promotes mucosal CD4+ T cell IL-10 production through altering microbiota to reduce intestinal ischemia reperfusion injury

本研究发现，PD-1阻断并非通过传统Tfh细胞，而是经由MyD88依赖的途径激活肠道黏膜免疫球蛋白A（IgA）反应。这重塑了肠道菌群，特别是增加了产丁酸菌（如Lachnospiraceae_NK4A136_group）的丰度，并提升了菌群代谢产物丁酸盐水平。增多的丁酸盐通过激活肠道黏膜CD4+T细胞内的PI3Kγ/磷酸化mTOR信号通路，促进抗炎因子白细胞介素-10（IL-10）的产生。最终，IL-10的上调抑制了肠道炎症，从而在肠缺血再灌注（IR）攻击后，改善了肠道上皮屏障（IEB）和肠道血管屏障（GVB）的破坏，减轻了肠道及远端器官（如肝脏）的损伤。该研究揭示了PD-1阻断在肠黏膜免疫稳态和损伤修复中的新作用机制。

　　

PD-1阻断促进肠道黏膜CD4⁺T细胞IL-10产生以减轻IR损伤

在建立肠道IR模型之前，与对照组相比，PD-1阻断并未显著改变肠道上皮屏障的病理评分、反映肠道血管屏障通透性的PV-1蛋白表达以及反映肝损伤的血清ALT和AST水平，表明在没有致病攻击的情况下，抗PD-1抗体对肠道屏障和肝功能的影响轻微。然而，肠道IR发生后，数据显示，接受PD-1阻断的小鼠，其肠黏膜和血清中的促炎因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）浓度均低于对照组。此外，PD-1阻断保护了肠道上皮屏障和肠道血管屏障的完整性，表现为降低的病理评分、二胺氧化酶（DAO）活性和PV-1表达，并减轻了肝脏损伤，表现为降低的ALT和AST水平、肝脏细菌负荷以及病理评分。这表明PD-1阻断抑制了黏膜组织的异常炎症激活，从而改善了肠道IR后的肠道屏障功能、细菌易位和远端器官损伤。

由于观察到肠道黏膜炎症减轻，研究人员假设PD-1阻断增强了肠道IR期间的抗炎因子产生。数据揭示，PD-1阻断并未影响CD4⁺T细胞的频率，但显著增加了派伊尔结、固有层和脾脏中产生IL-10的CD4⁺T细胞的频率以及IL-10的平均荧光强度。此外，在肠道派伊尔结和黏膜中，CD4⁺T细胞的IL-10表达以及组织与血清中的IL-10浓度均升高。后续实验使用抗IL-10抗体中和PD-1阻断诱导的IL-10上调。数据显示，与单纯PD-1阻断相比，IL-10中和显著增加了肠道IR后肠黏膜和血清中的炎症生物标志物水平，并显著削弱了PD-1阻断对肠道IR诱导的肠道屏障破坏和肝脏损伤的保护作用，表明PD-1阻断引起的IL-10上调有助于抑制肠道黏膜炎症，并改善肠道IR后的肠道屏障和肝损伤。

PD-1阻断重塑肠道菌群并促进丁酸盐产生

肠道菌群在塑造宿主免疫系统的发育和功能中发挥着不可或缺的作用。为了剖析PD-1阻断后肠道微生物的变化，研究人员分别对接受PD-1阻断和对照治疗的小鼠的肠道细菌群落进行了16S rRNA基因测序分析。分析显示，肠道菌群的α多样性指数（如Chao1、Simpson和Shannon指数）具有可比性，而β多样性主坐标分析显示PD-1阻断组与对照组形成了明显不同的聚类。线性判别分析效应大小分析揭示了两组间存在显著差异的微生物类群。在科水平上，PD-1阻断显著增加了毛螺菌科和螺杆菌科的相对丰度，并降低了Muribaculaceae的丰度。在属水平上，Lachnospiraceae_NK4A136_group、Roseburia和Alloprevotella的相对丰度在PD-1阻断小鼠中显著更高。此外，PD-1阻断导致了厚壁菌门丰度的增加，使得厚壁菌门/拟杆菌门的比值升高。值得注意的是，PD-1基因敲除小鼠表现出与PD-1阻断小鼠不同的菌群变化模式，例如毛螺菌科丰度降低，表明PD-1阻断诱导的肠道菌群重塑与PD-1缺陷小鼠观察到的菌群存在根本性差异。

由于Lachnospiraceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Roseburia是公认的短链脂肪酸产生菌，研究人员通过靶向代谢组学分析了小鼠粪便中的短链脂肪酸水平。结果显示，PD-1阻断后，丁酸水平显著增加，而丙酸和异戊酸水平降低。在PD-1阻断小鼠中，粪便中的Lachnospiraceae_NK4A136_group属丰度和丁酸盐水平与派伊尔结、固有层中产生IL-10的CD4⁺T细胞百分比以及肠黏膜中IL-10浓度呈正相关。

PD-1阻断通过重塑肠道菌群驱动肠道CD4⁺T细胞产生IL-10

微生物改变及相关性分析促使研究人员进一步探究肠道菌群的改变是否促进了PD-1阻断后小鼠肠道黏膜IL-10的产生上调。通过使用抗生素鸡尾酒来耗竭PD-1阻断治疗小鼠现有的菌群。结果显示，抗生素治疗显著削弱了PD-1阻断诱导的派伊尔结和固有层中产生IL-10的CD4⁺T细胞数量及IL-10平均荧光强度的增加。此外，抗生素处理还降低了黏膜淋巴结和肠黏膜中CD4⁺T细胞的IL-10表达，并减少了肠道派伊尔结和黏膜组织中IL-10的生成。然而，抗生素处理并未降低脾脏中产生IL-10的CD4⁺T细胞的频率和IL-10的平均荧光强度，也未降低PD-1阻断后血清中的IL-10浓度。

为了进一步确认PD-1阻断诱导的微生物改变对IL-10产生的贡献，研究人员进行了粪便菌群移植实验。与接受来自对照治疗小鼠粪便移植的受体相比，接受来自PD-1阻断治疗小鼠粪便移植的受体，其粪便中Lachnospiraceae_NK4A136_group和Roseburia的丰度增加，派伊尔结和固有层中产生IL-10的CD4⁺T细胞的频率和IL-10的平均荧光强度也增加，并且黏膜淋巴结和肠黏膜中CD4⁺T细胞的IL-10表达增强。此外，在这些受体中，肠道派伊尔结和黏膜组织中的IL-10浓度也显著升高，而脾脏中产生IL-10的CD4⁺T细胞的频率和血清中IL-10的浓度没有显著变化。抗生素耗竭和粪便菌群移植实验的结果表明，PD-1阻断诱导的微生物改变是增强肠道CD4⁺T细胞产生IL-10所必需的，而肠道外组织中IL-10的上调机制尚需进一步研究。

PD-1阻断通过MyD88途径增强肠道IgA激活和丁酸盐产生

由于微生物改变对PD-1阻断诱导的肠道黏膜IL-10上调至关重要，并且免疫球蛋白A反应在控制肠道菌群中起主要作用，研究人员接下来研究了PD-1阻断是否影响黏膜IgA免疫及其潜在机制。与对照治疗相比，PD-1阻断显著增加了生发中心、派伊尔结和固有层中IgA⁺B细胞的频率，增加了肠道B细胞的IgA表达和灌洗液中的IgA浓度。重要的是，肠道B细胞中激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）的表达以及肠道IgA的细菌结合能力在PD-1阻断小鼠中显著增强，表明黏膜IgA反应被PD-1阻断强烈激活。然而，PD-1阻断并未显著改变派伊尔结中滤泡辅助性T细胞的频率和数量，也未促进滤泡辅助性T细胞中白细胞介素-21和CD40L的表达，这表明传统的滤泡辅助性T细胞与B细胞相互作用并非PD-1阻断诱导的黏膜IgA激活所必需。

TLR/MyD88通路参与肠道中T细胞依赖性和非依赖性IgA的产生。与野生型小鼠相比，MyD88敲除小鼠在PD-1阻断后，其派伊尔结和固有层中IgA⁺B细胞的频率、灌洗液中的IgA浓度以及IgA的细菌结合能力均显著降低。值得注意的是，PD-1阻断诱导的丁酸盐上调在MyD88敲除小鼠中也显著减弱。这些发现表明，MyD88信号对于PD-1阻断诱导的黏膜IgA激活至关重要，并且IgA产生和细菌结合能力的增加显著改变了肠道菌群群落和菌群来源的丁酸盐的生成。

丁酸盐通过激活PI3Kγ促进黏膜CD4⁺T细胞产生IL-10并改善IR诱导的肠道屏障损伤

为了研究PD-1阻断诱导肠道CD4⁺T细胞表达IL-10的潜在机制，研究人员进行了转录组学分析以寻找差异表达基因。数据显示，PD-1阻断导致857个基因显著上调，700个基因下调。基因本体富集分析显示，差异表达基因富集在“免疫系统过程、免疫反应激活、淋巴细胞激活和黏膜免疫反应”等条目。京都基因与基因组百科全书通路分析显示，差异表达基因富集在“肠道IgA产生的免疫网络”和“细胞因子-细胞因子受体相互作用”通路。有趣的是，尽管差异表达基因在PI3K/Akt通路中未显著富集，但肠道CD4⁺T细胞中与PI3Kγ相关的基因Pik3r6的表达在PD-1阻断后显著增加。短链脂肪酸可通过GPR43-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路诱导肠道CD4⁺T细胞产生IL-10，而PI3Kγ是GPR43的直接下游分子。因此，研究人员假设PD-1阻断引起的肠道丁酸盐增加通过激活PI3Kγ诱导肠道CD4⁺T细胞产生IL-10。

为了验证这一假设，研究人员在小鼠的饮用水中添加了丁酸盐。数据显示，补充丁酸盐可独立增加派伊尔结、固有层和脾脏中产生IL-10的CD4⁺T细胞的频率和IL-10的平均荧光强度，并提高黏膜、脾脏和血清中IL-10的浓度。此外，补充丁酸盐显著增加了黏膜CD4⁺T细胞中PI3Kγ的分子表达和mTOR的磷酸化水平。随后，施用选择性PI3Kγ抑制剂AS-605240以进一步评估PI3Kγ上调在丁酸盐诱导的CD4⁺T细胞产生IL-10中的作用。结果显示，药理抑制PI3Kγ降低了磷酸化mTOR的表达，并消除了补充丁酸盐引起的派伊尔结、固有层和脾脏中产生IL-10的CD4⁺T细胞的上调，以及肠道、血清和脾脏中IL-10的增加。在体外实验中，用丁酸盐处理培养的CD4⁺T细胞，结果显示丁酸盐增加了产生IL-10的CD4⁺T细胞的频率和IL-10的平均荧光强度，并增加了培养上清液中IL-10的浓度。此外，敲低PI3Kγ显著降低了磷酸化mTOR的表达，并抑制了丁酸盐在培养细胞中诱导的IL-10上调。这些发现表明，丁酸盐至少部分通过激活黏膜CD4⁺T细胞的PI3Kγ来促进肠道IL-10的生成，而IL-10的上调随后限制了肠道黏膜的免疫和炎症反应。

正如预期，补充丁酸盐减轻了肠道IR后小鼠肠黏膜的病理评分、DAO活性和PV-1表达，表明丁酸盐是治疗肠道IR损伤的一个有前景的靶点。

综上所述，本研究揭示了PD-1阻断通过MyD88依赖的信号通路激活肠道IgA反应，导致肠道菌群及其代谢产物（特别是丁酸盐）的改变。重要的是，PD-1阻断诱导的丁酸盐增加或口服补充丁酸盐，通过上调PI3Kγ，促进肠道CD4⁺T细胞产生IL-10，从而在肠道IR损伤期间减轻肠道屏障的破坏，显示了PD-1阻断和丁酸盐在治疗肠道IR患者中的转化潜力。