肠道上皮Toll样受体4基因条件性敲除在活动性神经性厌食模型中对肠道屏障与微生物群产生性别特异性影响

本研究首次揭示了在活动性神经性厌食（ABA）小鼠模型中，诱导性敲除肠道上皮细胞特异性Toll样受体4（TLR4IEC-/-）如何差异化地影响能量稳态，并导致结肠炎症、肠道屏障功能和肠道菌群组成的性别特异性改变，为深入理解神经性厌食症中菌群-肠-脑轴的病理生理机制提供了新视角。

　　

引言

神经性厌食症是一种以体重过低、强烈怕胖和体像障碍为特征的严重进食障碍，具有精神疾病中最高的死亡率。活动性神经性厌食（ABA）小鼠模型被广泛用于研究该疾病，它能模拟患者的许多病理生理特征，包括运动模式改变、大脑功能与行为异常、肠道通透性增加和炎症标志物变化。先前研究表明，微生物-肠-脑轴在进食行为调节和神经性厌食症病理生理中扮演着重要角色。在ABA小鼠中，观察到肠道屏障功能受损和肠道炎症增加，特别是雌性ABA小鼠结肠黏膜中Toll样受体4（TLR4）的表达上调。TLR4主要识别革兰氏阴性菌的脂多糖，在调节摄食中起作用。有趣的是，全身性TLR4敲除小鼠在ABA模型中表现出高死亡率，而特异性敲除肠道上皮细胞中的TLR4（TLR4^IEC-/-）则对行为和能量稳态产生有益影响，且具有性别依赖性。本研究旨在深入探究ABA模型中肠道上皮TLR4敲除对能量稳态、肠道炎症反应和屏障功能的影响，并评估其在雌雄小鼠中的差异。

材料与方法

本实验获得了动物伦理委员会批准。研究人员通过将Villin-Cre^ERT2小鼠与TLR4_floxed小鼠杂交，获得Villin-Cre^ERT2TLR4_floxed小鼠，然后通过注射他莫昔芬（TMX）诱导特异性敲除肠道上皮细胞中的TLR4。对照小鼠注射磷酸盐缓冲液。敲除效率通过基因分型和测序验证。

ABA实验按既定方案进行。小鼠被饲养在配备跑轮的笼中，经过适应期后，进行渐进性的食物获取限制。在整个过程中，每天监测体重、食物和水的摄入量。实验结束时，采集血液、回肠、结肠和盲肠内容物样本。

通过酶免疫法测定血浆中的代谢调节肽（GLP1、PYY）、皮质酮、雌二醇和孕酮水平，并通过酶联免疫吸附试验定量粪便钙卫蛋白（肠道炎症标志物）。使用尤斯灌流室评估回肠旁细胞通透性。通过实时定量聚合酶链式反应测量结肠中43个与炎症反应、肠道屏障功能和进食行为调节相关的标志物的mRNA表达水平。通过蛋白质印迹法评估紧密连接蛋白的表达。通过Illumina MiSeq对16S rRNA基因V5–V6区进行测序，分析盲肠内容物的肠道菌群组成。此外，还评估了TMX本身对野生型小鼠摄食行为的影响。

结果

TLR4^IEC-/-以性别依赖性方式影响ABA模型中的能量稳态

与先前报道一致，野生型ABA小鼠在实验第16天出现体重下降。在对照条件下，TLR4^IEC-/-不影响雌雄小鼠的体重变化。然而，在ABA条件下，TLR4^IEC-/-以性别特异性的方式改变了体重下降模式：雌性和雄性TLR4^IEC-/-ABA小鼠在实验早期均表现出相对较轻的体重下降。

这种能量稳态的改变与体力活动和摄食行为的变化相关。雌性TLR4^IEC-/-ABA小鼠的总体力活动和夜间活动量低于野生型ABA小鼠，但其日间活动（包括食物预期性活动）未受影响。尽管摄食量降低，其体重下降却更轻。相反，雄性TLR4^IEC-/-ABA小鼠的总活动量未变，但夜间活动增加，日间活动减少，同时摄食量轻微增加。在对照条件下，TLR4^IEC-/-使雄性小鼠的摄食量略有增加，但不影响雌性。

肠道内分泌反应也呈现性别差异。在雌性中，ABA模型增加了结肠胰高血糖素原（Gcg）mRNA表达，特别是在TLR4^IEC-/-ABA小鼠中，但血浆GLP1和PYY水平无变化。在雄性中，TLR4^IEC-/-降低了CT和ABA条件下的Gcg mRNA水平，并且单独ABA或TLR4^IEC-/-均会降低血浆GLP1水平。此外，TLR4^IEC-/-改变了血浆PYY浓度，在CT雄性小鼠中呈升高趋势，但在ABA条件下此效应消失。

TLR4^IEC-/-以性别依赖性方式影响ABA模型中的肠道屏障功能

对结肠中19个与肠道通透性相关的基因标志物及黏蛋白Muc2的分析显示，雄性小鼠对TLR4敲除的反应更为明显。在对照条件下，雌性TLR4^IEC-/-小鼠仅显示闭合蛋白1（Cldn1） mRNA表达降低，而雄性TLR4^IEC-/-小鼠则表现出8个紧密连接相关基因（Ocln、Marveld2、F11r、Tjp1、Cldn7、Cldn12、Cldn15）的mRNA水平下调。TMX注射本身未复制这些效应。

ABA模型本身引起轻微变化：在雌性中上调了Cgn、Tjp1和Cldn7，下调了Cldn1；在雄性中仅下调了Tjp1。然而，在雄性TLR4^IEC-/-小鼠中，ABA模型引发了Ocln、Marveld2、F11r、Tjp1、Tjp2、Tjp3、Cldn3、Cldn7、Cldn12和Cldn15等10个基因mRNA表达的上调。在雌性TLR4^IEC-/-小鼠中，ABA则与Cldn2和Cldn15 mRNA水平升高相关。

当比较TLR4^IEC-/-ABA小鼠与野生型ABA小鼠时，两性均表现出部分基因表达的下调（雌性：Tjp1和Cldn7；雄性：Cgn和Cldn5）和上调（雌性：Cldn2和Cldn15；雄性：Cldn3和Cldn7）。蛋白质印迹结果显示，在雄性中，ABA模型本身增加了Cldn1和Ocln蛋白表达，而TLR4^IEC-/-部分削弱了此效应。Muc2 mRNA表达在两性中均无显著变化。尽管观察到基因表达的变化，但回肠旁细胞通透性未显示显著差异。这些数据凸显了肠道上皮TLR4在肠道屏障功能性别特异性调节中的潜在作用。

TLR4^IEC-/-以性别依赖性方式影响ABA模型中的肠道炎症反应

对结肠黏膜19个炎症标志物基因表达的分析表明，TLR4^IEC-/-成功降低了TLR4的mRNA水平。在对照条件下，雌性TLR4^IEC-/-小鼠仅显示髓样分化初级反应蛋白88（Myd88）、白细胞介素6（Il6）、C-X-C基序趋化因子1（Cxcl1）和C-C基序趋化因子2（Ccl2）的mRNA表达增加。相比之下，雄性对照TLR4^IEC-/-小鼠有8个炎症标志物mRNA水平下调，包括6个促炎因子（Tlr2、Ticam1、Irf3、Myd88、Tnfα、Cxcr3）和2个抗炎因子（Nfκbiα、Tgfβ）。与此一致，只有雄性小鼠在TLR4^IEC-/-后粪便钙卫蛋白浓度降低。TMX注射未引起类似变化。

在ABA条件下，TLR4^IEC-/-引起的这些差异在雌雄小鼠中基本消失（雌性Ccl2除外）。ABA模型本身也引起性别依赖性的炎症标志物变化。在野生型雌性ABA小鼠中，Nod2和Tlr4表达降低，Irf3和Myd88表达升高；在野生型雄性ABA小鼠中，Nod2、Irf3和Cxcr3降低，Ticam1和Nf-κb升高。在TLR4^IEC-/-背景下，ABA的影响进一步凸显性别差异。这些数据表明，在生理条件下，肠道上皮TLR4在调节雄性结肠炎症方面作用更重要，但为期12天的ABA环境削弱了这种现象。

TLR4^IEC-/-以性别依赖性方式影响ABA模型中的肠道菌群组成

通过16S rRNA测序分析盲肠菌群发现，在雌性中，TLR4^IEC-/-降低了CT和ABA小鼠的总细菌丰度，而ABA模型本身无影响。在雄性中，TLR4^IEC-/-和ABA模型似乎都降低了细菌丰度，但无叠加效应。Beta多样性分析显示，TLR4^IEC-/-改变了CT小鼠的菌群结构，此效应在ABA小鼠中被削弱。

在门水平上，雄性对照TLR4^IEC-/-小鼠的杆菌门（Bacillota）丰度增加。δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria），特别是其中的脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）和脱硫弧菌属（Desulfovibrio）的丰度也增加。雄性ABA TLR4^IEC-/-小鼠则显示放线菌门（Actinomycetota）丰度增加。相反，在雌性小鼠中，对照TLR4^IEC-/-导致β-变形菌纲（Betaproteobacteria，属于假单胞菌门Pseudomonadota）、伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）、产碱菌科（Alcaligenaceae）和 Parasutterella 属的水平升高。

值得注意的是，ABA模型使两性野生型小鼠的乳杆菌属（Lactobacillus）丰度均增加，但此现象在TLR4^IEC-/-ABA小鼠中消失。TMX注射本身会引起一些菌群变化，但并未复制TLR4^IEC-/-诱导的特定菌群改变。这些数据表明，TLR4^IEC-/-在对照小鼠中诱发了性别特异性的肠道菌群改变，且在雄性中更为显著。

讨论

本研究首次证明，肠道上皮TLR4以性别依赖性方式参与调节ABA模型中的能量稳态。有趣的是，肠道上皮TLR4敲除与更显著的结肠炎症标志物和肠道屏障功能调节因子改变相关，且在雄性小鼠中比在雌性中更为突出，这种差异存在于对照和ABA两种条件下。数据还表明，肠道上皮TLR4敲除导致了肠道菌群组成的性别特异性改变。

TLR4信号通路在黏液产生中发挥作用，并与神经性厌食症中观察到的黏液基因改变相关。本研究中使用的诱导性TLR4^IEC-/-模型（而非传统敲除）可能反映了肠道上皮细胞对TLR4缺失的早期反应。TLR4^IEC-/-在雄性中诱导的抗炎环境和肠道屏障因子改变，与先前使用传统敲除的研究结果有所不同，突显了模型差异。TLR4^IEC-/-关联的菌群改变，如雄性中脱硫弧菌科增加和雌性中Parasutterella及伯克霍尔德氏菌目增加，可能通过产生代谢物如硫化氢或影响脂质代谢，参与肠道稳态的性别特异性调节。

ABA模型中乳杆菌属的增加被认为是针对营养不良的适应性反应。TLR4^IEC-/-ABA小鼠中缺乏这种增加，可能与观察到的体重下降受限有关，提示乳杆菌或其益生菌制剂可能具有治疗潜力。此外，TLR4^IEC-/-在对照雄性中诱导的脱硫弧菌科增加在ABA条件下消失，而放线菌门的改变则特异性出现在雄性ABA TLR4^IEC-/-小鼠中，并与更多的炎症和屏障标志物改变相关，值得进一步研究。

本研究的局限性包括使用TMX可能通过雌激素受体产生脱靶效应，但对照实验表明TMX本身并未复制TLR4^IEC-/-的核心表型。此外，雄性ABA小鼠体重下降更显著，可能部分解释观察到的性别差异。性激素水平的初步数据显示TLR4^IEC-/-或ABA模型降低了雌性血浆雌二醇和孕酮，但其具体作用机制有待阐明。

结论

本研究为理解神经性厌食症病理生理中菌群-宿主互作提供了新见解，并凸显了肠道TLR4在肠道稳态中的作用，尤其是在雄性中。抑制肠道上皮TLR4可改善能量平衡，并伴随肠道菌群、屏障功能和结肠炎症通路的改变。未来研究应进一步评估肠道TLR4或Myd88通路拮抗剂在ABA模型中的治疗潜力，以及益生菌的作用。同时，需要深入解析TLR4介导的菌群-宿主对话被破坏后，对照与ABA小鼠反应差异的内在机制。