《Gut Microbes》：Spatial mapping of human colonic niches reveals rapid, mucus-specific microbiota disruption after bowel cleansing
引言
维持肠道微生物群与宿主间的稳定关系对肠道稳态及全身健康至关重要。这种相互作用很大程度上通过微生物群沿肠道轴的空间组织来介导，但由于采样技术的限制，其在人体中的解析仍面临挑战。管腔微生物群与嵌入黏液层和黏膜层的菌群存在显著差异，这些区域构成了具有独特代谢特征、复制动态和宿主相互作用的本地微生物生态位。然而，获取人体内空间分辨的微生物群落仍具有技术挑战性。内镜活检是研究黏膜相关微生物群的主要方法，但通常会混合来自松散黏附黏液、外层黏液和深层黏膜的细菌。此外，高宿主DNA含量可能进一步掩盖微生物谱。专门的在体黏液采样鲜有尝试，使得黏液层（尤其是其外层动态部分）的微生物结构在很大程度上未被探索。
肠道准备增加了问题的复杂性。口服泻药可加速肠道传输、改变营养可用性并物理性冲洗管腔生物量。尽管肠道准备对于结肠镜检查不可或缺，但其如何改变研究者试图测量的微生物群落至关重要。多项研究考察了肠道准备对肠道微生物组的影响，但结果不一致，且大多数工作集中在粪便或管腔样本上。仅有少数研究使用活检评估了黏膜相关群落，且这些研究在时间、采样间隔和准备方案上存在异质性。报告的微生物反应范围从最小的多样性变化到显著的群落转变。重要的是，这些研究均未考察不同结肠区室恢复的短期动力学，也未明确将黏液层作为独立的生态位点进行研究。
方法
为填补这些空白，本研究开发并应用了靶向内镜黏液采集策略，在肠道准备前后对人体结肠微生物群进行了多区室分析。该策略分离了外层黏液层，并实现了管腔、黏液相关和黏膜相关生态位的空间解卷积。通过整合在24小时内连续时间点采集的黏膜活检、管腔内容物和黏液抽吸物，旨在确定清肠对各生态位特异性微生物群落的即时影响，并表征其短期恢复动态。
研究涉及五名健康成年志愿者。采用纵向采样设计，包括准备前乙状结肠镜检查和准备后四个时间点：结肠镜检查后立即（0小时）、以及之后8小时、12小时和24小时。样本包括管腔内容物、黏膜活检和黏液抽吸物。肠道准备采用分剂方案使用PicoPrep?完成。
内镜手术使用带有高级双焦距光学系统的Olympus EVIS EXERA III视频结肠镜进行。准备前直肠乙状结肠镜检查在不镇静情况下进行，从直肠乙状结肠区域采集管腔内容物和黏膜活检。完成肠道准备后，参与者在丙泊酚镇静下接受结肠镜检查，从回肠、盲肠、横结肠、降结肠和直肠取样。在术后8、12和24小时进行额外的直肠乙状结肠镜检查，从相同解剖区域采集管腔内容物和黏膜活检。
尽管结肠镜检查期间从多个胃肠道位置采集了样本，但主要的纵向和恢复分析有意限制在直肠乙状结肠区域，这是唯一在所有准备前和准备后时间点一致采样的解剖部位。
为选择性采样外层黏液层，开发了内镜引导的抽吸技术。将一根6毫米气管支气管抽吸导管远端斜向切割以最大化表面接触。在内镜可视化下，将导管经肛门引入并与直肠黏膜切向放置。连接到近端的50毫升注射器产生负压，从而能够直接从黏膜表面抽吸黏液。黏液采集协议采用标准化、分步程序设计，以实现直肠黏膜界面的分层采样。
使用QIAamp DNA stool kit和AllPrep DNA/RNA Mini Kit分别从粪便/管腔内容物和活检样本中提取DNA。使用特异性引物扩增细菌16S rRNA基因的V5-V6高变区。在Ion PGM?系统上进行测序。原始序列文件导入QIIME2流程进行处理。在DADA2插件中，通过去除引物、过滤低质量读长和消除嵌合体来处理序列。使用预先训练的SILVA 132分类器通过feature-classifier classify-sklearn方法进行 taxonomy assignment。使用Shannon和Simpson指数计算Alpha多样性。使用基于相对丰度的Bray-Curtis相异性在属水平评估Beta多样性。使用PERMANOVA评估beta多样性的组间差异。对于多变量关联测试，应用MaAsLin2并进行Benjamini–Hochberg错误发现率校正。对于成对的、时间点特异性的差异丰度分析，使用DESeq2进行基于计数的建模。
结果
1. 肠道准备对微生物组成改变的影响
首先分析了107个黏膜活检和管腔内容物样本，生成4,126,271条高质量16S rRNA基因序列，聚类为79,752个ASV，提供物种水平分辨率。代表性参与者的时间轨迹表明，肠道准备引起了微生物组成的显著但短暂的扰动。Beta多样性分析显示，在乙状结肠和直肠，清肠后群落结构立即发生转变，随后在24小时内逐渐恢复到准备前状态。在分类学上，这种短暂干扰以变形菌门，特别是肠杆菌科和拟杆菌属的短暂扩增，以及普雷沃菌属、瘤胃球菌科和毛螺菌科成员的相应减少为特征。
对所有五名参与者的分析显示，管腔样本的Alpha多样性在准备前后无显著差异。活检样本的Observed ASVs略高，但Shannon和Simpson值较低。这些不一致的变化和显著的个体间差异表明，肠道准备并未系统性改变任一区室的Alpha多样性。相比之下，Beta多样性分析显示了区室特异性敏感性。管腔样本在准备前后状态之间没有显示出显著的组成差异。然而，活检样本表现出显著的准备后转变，表明黏膜相关微生物群比管腔群落更容易受到肠道准备的影响。基线管腔和活检样本的整体组成没有显著差异，突出了扰动 specifically 源于清肠过程而非样本类型之间的固有差异。
2. 志愿者之间细菌群落的变异
鉴于Alpha多样性缺乏一致变化以及Beta多样性中观察到的区室特异性效应，接下来研究了微生物组成在多大程度上由个体间变异而非肠道准备或样本类型决定。所有样本的Bray-Curtis相异性显示出按参与者身份的明显聚类，表明个体性主导了微生物景观，与肠道准备或采样区室无关。加权UniFrac分析揭示了一个次要结构层：参与者P3、P4和P5的样本聚集在一起，而P1、P2和P6的样本形成 distinct cluster。PERMDISP分析显示个体间的离散度 comparable。总之，这些发现强调了在健康成人中，个体间变异是微生物群落结构的主要驱动因素。
3. 肠道准备对黏膜相关微生物群生态系统的短期影响
由于个体性强烈主导整体微生物变异，接下来专注于个体内动态，以确定肠道准备如何随时间扰动黏膜相关群落。在活检样本中，Alpha多样性在肠道准备后呈现 transient decrease，最显著的减少发生在前12小时内。尽管这些变化未达到统计显著性，但模式表明对黏膜物种丰富度的 immediate disturbance 在24小时时 largely resolved，此时多样性指标恢复到与准备前 state 相当的水平。
Beta多样性分析提供了 disruption 的更强证据。Bray-Curtis相异性揭示了肠道准备后群落组成的显著转变。重要的是，准备后24小时采集的活检样本与准备前样本紧密聚集，表明黏膜相关微生物群在此时期内 substantial recovery。这种时间结构在分类学上得到反映：拟杆菌科、普雷沃菌科、丹毒丝菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科和肠杆菌科在清肠后最初12小时内表现出最显著的波动。
准备后12小时的差异丰度分析确定了6个在肠道准备前显著更丰富的ASV和18个在准备后显著增加的ASV。准备前活检中富集的ASV包括普雷沃菌属、粪球菌属、毛螺菌属、罗斯氏菌属的成员，以及来自瘤胃球菌科和毛螺菌科的未分类分类群。相比之下，准备后活检样本表现出属于瘤胃球菌属和拟杆菌属的ASV，以及来自丹毒丝菌科、肠杆菌科、毛螺菌科和瘤胃球菌科的分类群的更高丰度。
到准备后24小时，这些分类学差异 largely disappeared。只有两个属于普雷沃菌属的ASV相对于基线仍然显著改变，这与观察到的Beta多样性收敛回准备前状态一致。按时间点分层的分析证实，最强的 perturbation 在结肠镜检查时和清肠后8-12小时窗口内可检测到，之后黏膜群落重新组装向原始 configuration。
与活检相比，管腔内容物样本显示出最小的组成 disruption。Alpha多样性和Beta多样性在准备前后状态之间均无显著差异。值得注意的是，清肠后立即采集的管腔样本与准备前的样本几乎无法区分。DESeq2分析仅检测到准备后采集的管腔样本中属于肠杆菌科的两个ASV mild but significant increase，强调了清肠对该区室的最小影响。
总之，这些发现表明，肠道准备引起了黏膜相关微生物生态系统的 rapid but largely reversible restructuring，由梭菌目、拟杆菌目和肠杆菌目中特定分类群的 transient changes 驱动。
4. 肠道准备后直肠微生物群的分类学变化正在恢复到初始状态
为了表征肠道准备引起的短期分类学动态，比较了所有时间点在门和属水平上的微生物谱。在门水平，相对丰度模式显示出显著的个体间变异，涉及厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门的受试者特异性变化。尽管存在这种变异性，一个一致的模式出现：活检样本在清肠后立即显示变形菌门的 transient rise。这种增加在所有参与者中均可检测到，除了P5和P6，尽管不具有统计显著性，但与先前在健康和患病队列中的观察结果一致。
到准备后24小时，大多数受试者中拟杆菌门的相对丰度已恢复到准备前水平，而厚壁菌门仍然 slightly reduced。这很可能反映了早期恢复期间变形菌门的暂时扩增。为了在更高的分类学分辨率上解析这些动态，使用MaAsLin2进行了多变量关联分析。虽然大多数属水平的变化 modest 且未达到显著性，但 several reproducible trends emerged。在所有参与者中，观察到准备后拟杆菌属、副拟杆菌属、萨特氏菌属、嗜血杆菌属、瘤胃球菌属和未分类肠杆菌科分类群的增加。相反，普雷沃菌属、理研菌科和瘤胃球菌科的未分类成员以及毛螺菌属显示相对减少或保持稳定。
为了可视化群落水平的恢复，检查了捕获群落结构最大方差的主坐标轴。清肠后立即，所有参与者的样本都显示出与其基线位置的 clear displacement。然而，到24小时，大多数样本在PC1和PC2上都已回到接近准备前坐标。受试者P6、P5、P2和P1 nearly completely recovered，而P3和P4显示出 strong trajectories toward baseline，但可能需要 slightly more time 以达到完全恢复。这些时间轨迹提供了微生物群恢复力的 integrated view，表明尽管肠道准备引起区室特异性和个体化的分类学波动，特别是涉及拟杆菌科、普雷沃菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科、丹毒丝菌科和肠杆菌科的成员，但微生物群落 largely re-establish 其原始配置 within 24 hours。
虽然上述分析确定了肠道准备后黏膜相关扰动的幅度、时间和个体性，但并未解析是哪些黏膜层驱动了这些效应。因此，接下来应用黏液采集协议直接 interrogation 空间不同的黏液相关区室。
5. 黏液分辨采样揭示了直肠黏膜界面的离散微生物生态位
虽然纵向分析表明黏膜相关微生物群在肠道准备后比管腔群落经历更显著的组成转变，但这些黏膜生态位的空间微结构在体仍未被充分探索。外层黏液层 particularly 构成了管腔微生物和肠上皮之间的动态生物物理界面，但该层在人体中 rarely directly sampled。为了系统地表征栖居于此界面的微生物群落，开发了一种基于内镜的黏液抽吸协议，可从直肠选择性 harvest 外层黏液层。
已知结肠的黏液凝胶形成一个 distinct ecological niche，富含在 glycan-rich、低剪切力环境中繁衍的细菌分类群。通过我们的协议获得的黏液抽吸物揭示了一种明显区别于管腔抽吸物和标准活检的微生物群落组成。采样流程，包括管腔抽吸、靶向黏液抽吸、抽吸前活检和机械去除黏液后的第二次活检，使得能够对这些区室中的微生物群落进行空间解卷积。将完整协议应用于同一名个体两次（间隔数月）证明了 robust reproducibility，每个区室在两次操作中均保持特征性的分类学特征。为了直接评估黏液采集程序的技术可重复性，另外比较了使用相同抽吸协议从相同个体在两个不同日期采集的配对黏液样本。这些配对样本表现出低Bray-Curtis相异性和高度一致的属水平谱，表明 across sampling days 一致地回收了黏液相关微生物群落。重要的是，在黏液抽吸和冲洗后获得的第二次活检 consistently differed 于在自然条件下采集的初始活检，表明去除表层黏液层暴露了一个 deeper mucosa-associated microbial community，该群落不同于上覆的黏液 resident compartment。
差异丰度分析 reinforced this compartmentalization。几个属，包括萨特氏菌属、链球菌属、消化链球菌目、粪杆菌属、消化球菌属、 Finegoldia 属以及卟啉单胞菌科的未分类成员，在活检2中相对于活检1显著富集。这些分类群很可能代表了更黏附的、黏膜相关的群落，它们被屏蔽在表层黏液之下。相比之下，抽吸的黏液样本捕获了一个 distinct community，肠杆菌科在其中富集，这表明兼性厌氧菌 preferential colonize 外层黏液层而非更深的黏膜表面。
总之，这些发现证明了使用黏液抽吸协议成功分离了直肠内的空间 distinct microbial niches。能够顺序去除黏液层并比较去除黏液前后的活检，为在 luminal-mucosal interface 的分层微生物组织提供了 direct in vivo evidence。这一方法学进展为以空间分辨的方式 interrogation 微生物-宿主相互作用开辟了新的机会，揭示了通过标准管腔或基于活检的采样 otherwise inaccessible 的微生物群落。
6. 肠杆菌科的富集揭示了生态位特异性对肠道准备和机械干扰的敏感性
为了进一步表征肠道准备如何扰动跨肠道区室的特定分类群，重点关注了肠杆菌科，这是一个已知在生态 disturbance 下扩增的兼性厌氧科。多变量分类学建模识别了几个在清肠后丰度显著改变的细菌科，其中肠杆菌科显示出 one of the most consistent responses。在所有受试者中，肠道准备后采集的样本显示出肠杆菌科相对丰度的 marked increase，这与多份将变形菌门扩增与 dysbiosis、快速传输或腹泻状态联系起来的报告一致。
分层分析 across compartments 揭示了一个 striking niche specificity。抽吸的黏液样本表现出最高水平的肠杆菌科，显著超过在管腔内容物或活检中发现的水平。这种 preferential enrichment 表明，外层黏液层作为一个微环境，其中兼性厌氧菌具有 competitive advantage，很可能由其更高的氧气可用性、更丰富的糖缀合物含量和动态结构特性驱动。
支持这一解释的是，用内镜水射流 vigorous flushing 显著降低了目标部位的肠杆菌科丰度。机械 displacement 去除了肠杆菌科 concentrated 的松散黏附的表层黏液层，揭示了一个 deeper microbial consortium，其中 brachyspira 属、毛梭菌属和普雷沃菌属富集。这些分类群是更稳定、厌氧黏膜生境的 characteristic，很可能位于易受扰动的表层黏液之下。
最后，集成的空间表示突出了远端结肠生态位的 hierarchical organization。肠杆菌科 concentrated 在易于分离的外层黏液层内，而 deeper mucus strata 包含了一个 more diverse anaerobic community， characteristic of a more stable and oxygen-restricted environment。相比之下，黏膜可及的活检层显示出 yet another distinct compositional profile，反映了在去除表层黏液后保留的更深、紧密黏附的微生物群落。总之，这些空间模式强调了直肠微环境的 multilayer architecture 以及每个区室对扰动的 differential susceptibility。
这种 spatial layering 直接解释了为什么肠道准备后的肠杆菌科扩增几乎 exclusively 出现在表层黏液区室，而不是均匀地 across colonic habitats。这种 localization 强调了需要空间分辨的采样方法，因为传统的管腔或基于活检的方法 overlook 局限于外层黏液生态位的扰动。
讨论
多项人体研究考察了肠道准备如何影响肠道微生物组，主要集中在 intensive purging with laxatives 和 clear-liquid diet 后黏膜相关结肠细菌的变化。然而，这些变化的时间动态和区室特异性仍未完全理解。通过整合管腔内容物、黏膜活检和一种在体黏液抽吸物，我们的研究首次提供了清肠诱导的跨 distinct colonic niches 微生物变化的高分辨率、短期轨迹。此外，我们引入了一种 novel endoscopic mucus-harvesting protocol，能够直接采样表层黏液层，这是一个在先前的 work 中 largely inaccessible 的区室。
使用这种方法，我们确定了三个核心原则：i) 肠道准备诱导的微生物干扰主要在黏膜而非管腔群落中检测到；ii) 反应 strongly individual-specific；iii) 大多数改变 rapidly resolve，微生物谱在24小时内返回 baseline。值得注意的是，肠杆菌科的增殖几乎 exclusively 发生在表层黏液层内，并且通过靶向冲洗显著减少，这强调了在评估黏膜微生物群时需要进行空间分辨采样。尽管管腔和基于活检的分析提供了 essential context，但本研究的主要见解来自于解析了传统内镜采样 invisible 的黏液特异性微生物区室。
PicoPrep? 增加了管腔内水含量并加速传输， resulting in efficient evacuation of luminal material。虽然这一过程 substantially reduces microbial biomass，但我们观察到在清肠后管腔内容物的Alpha或Beta多样性没有显著变化，这与先前的粪便研究一致。管腔中的分类学组成 largely preserved，表明许多分类群被 proportional washout，产生稀释效应而非选择性重塑。相比之下，黏膜活检在清肠后显示出 clear, transient dysbiosis-like signature，Beta多样性和差异丰度发生显著变化。这些区室特异性效应与早期报告一致，表明活检衍生的群落（富含黏附、氧敏感分类群）比粪便或管腔样本更容易受到肠道准备的影响。因此，我们的发现强化了基于活检的微生物组研究必须在 acute perturbation 的背景下解读准备后数据。
个体间变异是我们数据集的一个 dominant feature，在横断面比较中 overshadowing 了与清肠相关的效应。与 established literature 一致，表明健康成人中强烈的个体特异性微生物 signature，样本按个体跨区室和时间点 robustly clustered。这种个体性 underscore 了纵向 within-subject 分析对于检测 transient perturbations 的重要性；肠道准备诱导的 subtle shifts 在个体间比较中 largely masked。
在个体内部，黏膜群落经历了 measurable but reversible restructuring。Alpha多样性显示出 short-lived decline，Beta多样性分析揭示了清肠后 immediate 的显著组成 displacement，大多数受试者在24小时内恢复到接近 baseline structure。在分类学上，最一致的早期转变涉及变形菌门，特别是肠杆菌科的增殖，这些模式先前与 dysbiosis、腹泻状态和管腔氧张力的变化相关。这些扰动 likely reflect 灌洗期间和之后微环境条件的改变，包括氧合、营养暴露和剪切力的变化。
我们的黏液采集协议提供的空间映射揭示了一个重要的 refinement：肠杆菌科的增殖不是均匀分布的，而是几乎 e
