《Frontiers in Immunology》：Structure and immunological activity of QS-21 variant from Quillaja saponaria aerial biomass
编辑推荐：
本工作鉴定了从栽培于美国的智利皂树幼株地上组织（叶、嫩枝）中天然富集的QS-21鼠李糖变异体（QS-21-Rha），其在化学结构（C3端为鼠李糖而非木糖）、纯度（>95%单一异构体）、免疫活性（诱导强大的CD4+T细胞反应，与乃至超过传统树皮来源的QS-21）和可持续性（可再生采收，产量远高于树皮来源）方面展现出显著优势，为疫苗佐剂供应安全与全球疫苗可及性提供了新解决方案。
引言：QS-21的重要性与供应挑战
QS-21是一种从智利特有的智利皂树（Quillaja saponaria）中提取的高效免疫刺激三萜皂苷。它是美国食品药品监督管理局（FDA）已批准的七种佐剂配方中两种的关键成分，广泛应用于多款重要疫苗中，例如带状疱疹疫苗Shingrix?、呼吸道合胞病毒疫苗Arexvy?、疟疾疫苗Mosquirix?和R21/Matrix-MTM，以及处于III期临床试验阶段的结核病疫苗候选株M72/AS01E。其刺激体液免疫和细胞免疫的双重能力使其在全球健康领域的需求迅速增长。
目前，所有商业化疫苗使用的QS-21均来源于智利野生成熟智利皂树的树皮。这些树木需要生长25-30年才能获得可提取的树皮，传统的采收过程常导致树木死亡，过度采伐已造成生态破坏并引发政府监管限制，形成了脆弱且不可持续的供应链。从化学角度看，树皮来源的QS-21是一种异质混合物，主要包含两种异构体：QS-21-芹糖（QS-21-Api，约65%）和QS-21-木糖（QS-21-Xyl，约35%），以及难以完全去除的杂质（如“组分2018”）。复杂的多步纯化工艺最终产率极低（相对于起始树皮约0.06% w/w），导致市场价格极为昂贵。
QS-21的结构、当前生产瓶颈与替代方案
QS-21是一个两亲性三萜皂苷分子，其结构可分为四个区域：连接在奎拉酸三萜核心C3位的支链三糖（通常为葡萄糖醛酸-半乳糖-木糖）、连接在C28位的线性四糖（岩藻糖-鼠李糖-木糖/芹糖）以及一个水解不稳定的酰基链。这种结构复杂性是其免疫活性的基础，也增加了纯化难度。
为克服树皮来源的瓶颈，学术界和工业界探索了多种生物技术替代方案，如通过植物（本氏烟草）或酵母（酿酒酵母）的异源生物合成，以及植物细胞培养。然而，这些方法目前产率极低（约0.1-1 mg/L），且均致力于复制传统的QS-21异构体，并未从根本上解决产量、成本和规模化问题，生产成本仍与传统方法相当。
研究焦点转向天然变异体：QS-21-鼠李糖
与以往工作不同，本研究聚焦于一个结构独特、天然存在的变异体——QS-21-鼠李糖（QS-21-Rha）。其结构特征是在C3三糖末端以鼠李糖（Rha）取代了木糖（Xyl）。先前有专利文件记载了通过育种降低“R系列”（含C3-鼠李糖）皂苷含量，以简化传统QS-21纯化的策略，但这主要是基于生产工艺考量，而非对QS-21-Rha免疫潜力的评估。迄今为止，尚未有研究报道纯化形式的QS-21-Rha或其作为疫苗佐剂的评估。
本研究填补了这一空白，旨在从美国加州栽培的2-3年生智利皂树幼株的地上组织（叶和嫩枝）中分离QS-21-Rha，并评估其佐剂活性。这种方法的优势在于，地上组织可以持续、重复采收而不伤害植株，从根本上将QS-21的生产从依赖智利野生老树的破坏性、低产模式，转变为可再生、高产、经济高效的新平台。
QS-21-Rha的鉴定、结构分析与丰度
化学组成分析
对幼株叶和嫩枝水提物的UPLC/MS（超高效液相色谱-质谱联用）分析表明，其皂苷组成与树皮提取物截然不同。地上生物质中以QS-18-Rha和QS-21-Rha为主，而传统的QS-21异构体（m/z 1988）含量仅为痕量。相比之下，树皮提取物含有复杂的异构体混合物，包括QS-7、QS-17、QS-18和QS-21的木糖/芹糖变体。分析显示，在幼株地上生物质中，QS-21-Rha占所有QS-21类变异体的95%以上。
结构确证
通过高分辨率串联质谱（MS/MS）和核磁共振（NMR）光谱，本研究确证了QS-21-Rha的结构。高分辨ESI-MS显示其分子离子[M–H]-为m/z 2001.9218，比QS-21高14 Da，提示戊糖被脱氧己糖取代。MS/MS分析中，一个关键的三糖诊断碎片离子出现在m/z 969.4661（QS-21的对应碎片为m/z 955.4539），这14.0122 Da的质量差精确对应于鼠李糖（164.0685 Da）取代木糖（150.0528 Da）。进一步的1D和2D NMR研究，包括1H、13C、HSQC、HSQC-TOCSY和HMBC，确认了鼠李糖甲基基团的存在，并通过HMBC谱中鼠李糖异头氢与葡萄糖醛酸C3的三键相关，确定了鼠李糖在C3位的糖苷键连接。这些数据共同证实QS-21-Rha与QS-21的结构差异在于C3末端是鼠李糖而非木糖。
丰度与产量优势
定量分析显示，2.5年生智利皂树幼株的地上生物质中，总皂苷含量可达7.0-11.2% w/w，其中QS-21-Rha平均占比为12.9-23.2%。以干重计，这相当于1.4-2.3%的QS-21-Rha产率。相比之下，成熟树木（>50年）的树叶中QS-21-Rha含量仅为0.3-0.6%，而树皮中传统QS-21的产率更是低至约0.25%。因此，从幼株地上组织获取QS-21-Rha的产量是树皮来源传统QS-21的6-9倍。
从生产规模估算，每年从约200株幼株的地上生物质可再生采收可获得1公斤QS-21-Rha。而要获得1公斤传统QS-21，则需要约1700公斤树皮，相当于砍伐和剥皮100-120棵30年以上的野生老树。这凸显了地上生物质路径在可持续性和原料供应上的巨大优势。
QS-21-Rha的免疫学活性评估
体外免疫刺激活性
将纯化的QS-21-Rha与传统的树皮来源QS-21分别配制到常规的DOPC-胆固醇脂质体中，两者粒径分布相似。在人体全血体外实验中，两种脂质体在4 μg/mL浓度下均能显著诱导单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的产生，且QS-21-Rha脂质体的刺激水平与树皮来源QS-21脂质体无统计学差异，表明两者具有相当的先天免疫刺激能力。
体内免疫原性评估
在小鼠体内实验中，研究人员比较了QS-21-Rha脂质体与树皮来源QS-21脂质体（各含2 μg佐剂）在配伍临床阶段结核疫苗抗原ID93时的佐剂效果，并评估了与TLR4激动剂GLA-AF联用的效果。
- •
细胞免疫反应：QS-21-Rha脂质体诱导了比传统QS-21脂质体更强的抗原特异性CD4+T细胞反应。
- •
在流式细胞术分析中，QS-21-Rha脂质体诱导了显著更高比例的IFNγ+、IL-2+和TNFα+的记忆性CD4+T细胞。CD154+（CD40L，T细胞活化重要标志物）CD4+T细胞的百分比也呈更高趋势。
- •
传统QS-21脂质体仅在联用GLA后，其诱导的IFNγ+CD4+T细胞比例才显著高于对照组；而QS-21-Rha脂质体单独使用时已能诱导强反应，联用GLA后提升不显著。
- •
ELISpot分析进一步证实，QS-21-Rha脂质体诱导了更多的IFNγ分泌脾细胞，并显示出诱导一些IL-17和IL-5反应的潜力，提示其可能具有独特的免疫刺激特性。
- •
体液免疫反应：两种QS-21脂质体均能诱导显著高于对照组的抗原特异性总IgG、IgG2c和IgG1抗体滴度，表明能激发平衡的抗体反应。
- •
传统QS-21脂质体联用GLA后，其诱导的IgG和IgG2c滴度显著增加；而QS-21-Rha脂质体单独使用时抗体反应已处于较高水平，联用GLA后增幅未达统计显著性。
- •
在骨髓中，QS-21-Rha脂质体诱导的抗原特异性长效抗体分泌细胞（ASC）数量显著高于传统QS-21脂质体。两者联用GLA后，均可诱导等效且更强的B细胞反应。
综上所述，QS-21-Rha在脂质体剂型中展现出强大且平衡的免疫刺激活性，其诱导的CD4+T细胞反应（特别是Th1型反应）在强度上等于乃至超过了传统树皮来源的QS-21。一个值得注意的特点是，QS-21-Rha单独使用时已能诱导较强的免疫反应，对TLR4激动剂GLA的依赖性似乎低于传统QS-21，这提示其作用机制可能存在差异。
结论与展望
本研究首次成功从智利皂树幼株地上生物质中分离、纯化出高纯度（>98%）的QS-21-鼠李糖（QS-21-Rha），并全面评估了其作为疫苗佐剂的免疫活性。研究证实，QS-21-Rha是一个化学结构明确、免疫活性强大（尤其擅长诱导强效的CD4+T细胞活化）的疫苗佐剂候选物。
这项工作的产业影响深远。它将QS-21的生产从依赖智利野生老树、不可持续且生态破坏性的树皮提取模式，转变为基于人工栽培幼株、可再生的地上生物质采收模式。该模式具有产量高、化学组分均一（单一异构体，简化了纯化和质控）、成本效益好和快速可扩展的突出优势。与目前产率极低的植物细胞培养或合成生物学平台相比，农业种植路径在可持续性、经济性和规模化能力上更具现实可行性。
因此，采用源自栽培植株地上组织的QS-21-Rha，有望解决当前QS-21供应链的脆弱性问题，降低生产成本，提高产品一致性，并为扩大全球疫苗可及性、增强大流行病防范和应对新发传染病的能力，提供一条可靠、可持续的新路径。
