长期间歇性θ脉冲刺激通过GluN2A介导的信号通路增强海马可塑性

推荐 本文揭示了为期一周的间歇性θ脉冲刺激（iTBS600）在健康大鼠海马中驱动了协调的结构、功能和分子可塑性。研究发现，该刺激通过上调NMDA受体（特别是GluN2A亚基）和脑源性神经营养因子（BDNF），激活下游Akt、ERK1/2和mTOR信号通路，从而增加树突棘密度、调节钙离子动态并促进神经网络重塑，为iTBS的神经调控治疗机制提供了重要洞见。

　　

文章内容总结

1 引言

经颅磁刺激（TMS）是一种安全、非侵入性的大脑调控技术，其中重复经颅磁刺激（rTMS）能够诱导持久的神经可塑性后效应，在多种神经精神疾病的治疗中展现出潜力。θ脉冲刺激（TBS）作为一种特定的rTMS范式，在2007年被引入，它能显著缩短治疗时间，并已在临床实践中用于治疗单相和双相抑郁、戒烟、强迫症等症状。然而，尽管rTMS的应用日益广泛，其临床转化的进展仍受限于对分子机制和特定介质的理解不足，许多研究结果存在冲突，且缺乏最佳刺激参数的共识。因此，在实验动物模型中探究rTBS的机制，对于确定其有效性和可重现性至关重要。本研究的核心机制假说认为rTMS效应基于长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD），涉及N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPAR）和脑源性神经营养因子（BDNF）等分子的变化。本研究的目的是对健康的Wistar大鼠海马进行为期7天、每日两次的间歇性θ脉冲刺激（iTBS600，共600个脉冲），旨在探究其在行为、结构、突触和钙离子依赖水平上的效应，以阐明iTBS在健康大脑中诱导神经可塑性的生物学基础，为未来的临床转化研究提供框架。

2 材料与方法

研究使用了2.5个月大的雄性Wistar大鼠和Grin2a基因敲除小鼠。iTBS600协议通过“8”字形线圈施加，每次持续192秒，每天进行两次，连续七天。假手术组动物接受声音伪影、手持和轻微接触压力，但不进行磁刺激。行为学分析包括旷场实验（OFT）评估自发活动力和焦虑样行为，以及新物体识别测试（NORT）评估短期识别记忆。结构可塑性通过c-Fos免疫染色、改良高尔基-考克斯染色和树突棘形态学分析进行。通过分离纯化的海马突触体进行蛋白质免疫印迹分析，检测谷氨酸能信号、BDNF及其下游信号通路的关键蛋白表达。通过钙成像评估急性与长期iTBS对原代海马神经元自发和诱发Ca²⁺活性的影响，并使用选择性NMDA受体拮抗剂D-AP5以及Grin2a敲除神经元探究其机制依赖性。全细胞膜片钳记录用于评估iTBS对神经元内在兴奋性和动作电位特性的影响。

3 结果

3.1 长期iTBS不影响基础行为功能

长期iTBS并未改变动物的一般健康状况、体重增加或社会行为。OFT和NORT测试表明，刺激前后的自发活动力、焦虑样行为以及短期识别记忆均无显著差异，表明基线行为功能得以保留。

3.2 长期iTBS诱导海马CA1区锥体神经元的结构可塑性

c-Fos染色显示，iTBS处理后，只有海马CA1亚区的c-Fos阳性神经元数量显著增加。高尔基染色分析发现，iTBS处理使CA1区锥体神经元基底树突棘的总密度增加了约17%。形态学分析表明，iTBS选择性地增加了与学习相关的薄树突棘、长薄树突棘、分支棘和丝状伪足的比例，同时轻微减少了蘑菇棘的比例。突触体分析显示，突触前膜标记物突触素（SYN）和突触成熟指标GluR1表达上调，而突触后致密蛋白PSD-95无显著变化。这提示iTBS促进了树突棘形成和早期突触发生。

3.3 长期iTBS上调GluN1/GluN2A信号并激活下游通路

对纯化海马突触体的分析显示，iTBS处理后，NMDA受体的GluN1和GluN2A亚基表达显著上调，而GluN2B亚基无变化。同时，突触体中的BDNF水平升高了约30%。下游信号通路方面，蛋白激酶B（Akt）、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的磷酸化水平均显著增加，表明TrkB-BDNF信号通路被激活。这些分子变化与观察到的LTP样可塑性现象一致。有趣的是，谷氨酸转运体VGLUT1的表达下降，而星形胶质细胞谷氨酸转运体EAAT1和EAAT2的表达上调，这可能是一种补偿机制，以维持突触间隙谷氨酸稳态，应对增强的NMDAR信号。

3.4 长期iTBS增强海马中间神经元周围网络

围绕海马各亚区（CA1-CA3）的parvalbumin（PV）阳性中间神经元，研究人员检测了其周围神经网（PNN）的强度。结果表明，长期iTBS处理显著增强了所有海马亚区PV+神经元周围PNN的强度，其中CA2区最为明显。同时，PV蛋白的胞浆表达在iTBS组中显著降低。PNN的增强和PV表达的变化可能反映了抑制性环路为响应兴奋性突触增强而进行的适应性重塑，以维持网络的兴奋/抑制平衡。

3.5 急性和长期iTBS均能改变Ca²⁺动态

在原代海马神经元中进行的钙成像实验表明，与假手术组相比，无论是单次（急性）iTBS还是为期一周的长期iTBS，均能显著增加自发Ca²⁺波动的振幅。长期iTBS还能显著增加自发波的频率。在给予高钾溶液诱发去极化时，急性和长期iTBS均能增加Ca²⁺响应峰值。然而，只有长期iTBS能够独特地延长钾离子诱发Ca²⁺响应的持续时间（尾部积分增加），这表明长期刺激诱导了更持久的Ca²⁺稳态改变。

3.6 iTBS诱导的Ca²⁺动态变化部分依赖于NMDA受体

为探究谷氨酸能信号在iTBS效应中的作用，在长期iTBS处理期间，每天在刺激前10分钟施用NMDA受体选择性拮抗剂D-AP5。结果显示，D-AP5处理完全阻断了iTBS诱导的自发Ca²⁺活动积分和谷氨酸诱发的Ca²⁺响应尾部的增加，但并未显著影响自发波的频率。这表明iTBS对Ca²⁺稳态的调节至少部分依赖于NMDA受体的激活。

3.7 GluN2A亚基是iTBS效应的关键分子

利用Grin2a敲除小鼠的原代海马神经元，研究人员进一步验证了GluN2A亚基的功能必要性。结果显示，在缺乏GluN2A亚基的神经元中，长期iTBS诱导的自发Ca²⁺波振幅、频率、钾离子诱发的Ca²⁺响应峰值及其尾部积分等所有增强效应均被消除。蛋白质免疫印迹分析也表明，在野生型神经元中，iTBS显著上调了p-ERK1/2和BDNF的表达，而在敲除神经元中，这种上调效应显著减弱（ERK1/2）或幅度大大降低（BDNF）。这直接证明了iTBS的分子和功能效应依赖于GluN2A亚基。

3.8 长期iTBS选择性地影响动作电位特性而非内在兴奋性

膜片钳记录结果显示，长期iTBS并未改变原代海马神经元的静息膜电位、膜电阻、膜电容、基强度或输入电阻，表明其内在兴奋性未受影响。然而，iTBS处理显著改变了动作电位的特性，包括增加了动作电位的最大上升斜率、峰幅值和峰值，同时降低了后超极化振幅。这些变化表明iTBS增强了动作电位的产生效率，而这一效应是在不改变神经元基础兴奋性的情况下实现的。

3.9 长期iTBS产生持久的后效应

初步研究评估了刺激结束后的长期效应。在最后一次刺激后7天和14天，对分离的突触体进行分析发现，磷酸化PSD-95（Ser²⁹⁵）在7天后仍有升高趋势，磷酸化GluR1在7天和14天后有约20%的升高。GluN2A的表达在刺激后1天显著升高，并在7天和14天后有维持趋势。突触素的表达则呈现出先升高、后短暂降低、再升高的动态双相模式。这些结果表明，iTBS诱导的突触变化可能具有持久性，有助于未成熟突触的成熟和稳定。

4 讨论

本研究在健康动物模型中证实，为期一周的iTBS600协议虽未引发明显的焦虑或记忆行为改变，但驱动了海马区协调一致的结构、功能和分子可塑性。其核心机制在于上调NMDA受体（特别是GluN2A亚基）和BDNF，进而激活下游Akt/ERK/mTOR信号通路，促进“学习型”薄树突棘的形成，增强Ca²⁺动态反应，并重塑抑制性中间神经元周围的神经网络。研究强调了在没有明确学习任务的情况下，增强的突触可塑性可能不会直接转化为行为表现，但其建立的“促可塑性”分子和结构基础，为理解iTBS在病理状态下（如神经退行性疾病或精神疾病）可能发挥的治疗作用提供了重要机制框架。这些发现不仅加深了对iTBS神经调控机制的认识，也为优化其临床治疗方案、开发基于特定分子靶点的联合治疗策略奠定了理论基础。