《Frontiers in Immunology》：Integrative single-cell, spatial, and bulk transcriptomics reveal an FMR1–FTO axis linked to the immune-excluded phenotype in gastric cancer
编辑推荐：
本文通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学（ST）及功能实验，系统解析了胃癌（GC）免疫微环境（TME），特别是“免疫排斥”表型的空间调控机制。研究发现，肿瘤核心区m6A调控网络评分升高，与成纤维细胞（CAF）构建的胶原屏障（T细胞物理排斥）高度耦合。其中，RNA结合蛋白FMR1与m6A去甲基酶FTO存在相关性，并通过蛋白酶体途径调节FTO蛋白稳定性，该FMR1–FTO轴是导致免疫排斥和免疫检查点抑制剂（ICI）疗效差的关键分子模块。研究为逆转胃癌免疫耐药提供了新的潜在靶点。
单细胞与空间维度解析胃癌免疫排斥全景并揭示FMR1–FTO调控轴
引言：胃癌免疫治疗困境与免疫排斥表型
胃癌（Gastric Cancer, GC）在全球范围内发病率和死亡率均居前列，具有高度的分子和表型异质性。尽管免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）疗法改变了晚期胃癌的治疗格局，但客观缓解率（ORR）仍然有限，大部分患者面临原发性耐药。其中，“免疫排斥”表型是胃癌中尤为常见的一种免疫微环境状态，其特征是效应T细胞被由癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）和细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）沉积构成的致密基质屏障物理性地隔离在肿瘤巢之外，形成一种独特的“冷肿瘤”状态，严重限制了抗肿瘤免疫。本研究旨在通过整合多组学技术，系统性解析胃癌免疫排斥表型的空间特征与分子驱动机制。
单细胞转录组图谱构建与成纤维细胞-T细胞互作网络解码
通过对来自胃癌和正常组织的11.7万个高质量细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，研究构建了胃癌的单细胞转录组图谱，识别出上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞及T细胞、B细胞等多种免疫细胞亚群。功能富集分析证实，T细胞富集于T细胞受体信号通路，而成纤维细胞则活跃于ECM组织等过程。利用CellChat工具重建细胞间通讯网络发现，成纤维细胞是微环境中的核心通讯枢纽，与T细胞存在强烈的相互作用。成纤维细胞通过分泌CXCL12（结合T细胞的CXCR4受体）以及产生胶原蛋白（与T细胞整合素相互作用）等方式，形成免疫抑制轴和物理屏障。反之，T细胞也通过MIF-ACKR3等信号轴反馈调节成纤维细胞。这为“免疫排斥”表型的形成提供了关键的单细胞证据。
空间转录组学揭示m6A相关的免疫排斥表型与成纤维细胞屏障
为了在空间维度解析免疫排斥，研究对胃癌组织切片进行了高分辨率空间转录组学（Spatial Transcriptomics, ST）分析。通过整合单细胞反卷积与空间坐标映射，重构了肿瘤细胞、成纤维细胞和T细胞的空间分布。结果清晰地捕捉到了典型的“免疫排斥”表型：肿瘤巢（红色）被富含成纤维细胞（CAF，绿色）的致密屏障包裹，导致T细胞（蓝色）被限制在基质或侵袭前沿，无法浸润至肿瘤核心。同时，研究基于21个经典m6A调控因子（包括写入器、擦除器和阅读器）的表达计算了复合m6A调控因子评分。空间叠加分析显示，高m6A评分特异性地富集在肿瘤巢区域，而周围的基质区评分较低。定量分析证实，肿瘤巢的m6A评分显著高于周围富含CAF的基质。这些发现揭示了肿瘤内在的m6A调控网络激活与外围CAF物理屏障形成、T细胞排斥之间存在空间耦合。
基于m6A调控因子的分子分型揭示肿瘤微环境异质性
研究整合了五个独立的胃癌转录组队列（总计n=1050），基于21个m6A调控因子的表达谱进行无监督一致性聚类，鉴定出三个稳定的分子亚型（Cluster 1-3）。基因集变异分析（GSVA）揭示了各亚型独特的免疫和基质特征：Cluster 3表现出“免疫炎症”表型，T细胞受体信号通路等适应性免疫通路显著激活；Cluster 2则被定义为“基质驱动的免疫排斥”表型，在“粘着斑”、“ECM-受体相互作用”等基质重塑通路上特异性富集；Cluster 1则表现为免疫和基质反应均不活跃的“免疫沙漠”表型。加权基因共表达网络分析（WGCNA）进一步识别出与Cluster 2（排斥表型）最正相关的基因模块（MEblue），其枢纽基因显著富集于PI3K-Akt、Wnt信号通路、粘着斑和ECM-受体相互作用等通路，表明该基因网络主动协调基质重塑和胶原沉积，从而构建物理屏障。
TIDE分析描绘免疫微环境异质性并预测免疫治疗反应差异
通过整合ESTIMATE、ssGSEA和TIDE算法对亚型进行多维表征。Cluster 3具有最高的免疫评分和ESTIMATE评分，富含活化的免疫细胞，PD-L1（CD274）表达也较高，提示其可能从免疫检查点抑制剂（ICI）治疗中获益最大。Cluster 2则呈现“高浸润、低功能”的矛盾状态：尽管有显著的CD8+T细胞浸润，但其基质评分、CAF评分、T细胞排斥评分和T细胞功能障碍评分均为最高。这表明CAF主导的基质纤维化构建了物理屏障，限制T细胞穿透并诱导其耗竭，是导致该表型对ICI原发性耐药的主要原因。基于TIDE算法的预测显示，Cluster 2的预计应答率最低（约24%），而Cluster 3最高（约70%）。Cluster 1由于缺乏活跃的免疫抑制机制，其预测应答率也较高，但需谨慎解读。
临床预后风险分层模型的构建与验证
生存分析显示，具有免疫排斥表型的Cluster 2患者总生存期最差。桑基图显示Cluster 2富集于晚期（III-IV期）胃癌患者。单因素和多因素Cox回归分析证实，在排除性别等非显著因素后，Cluster 2是独立的预后不良风险因素（HR = 1.444）。研究进一步整合m6A分型、年龄和临床分期构建了预测个体化总生存期的列线图，其校准曲线和随时间变化的ROC曲线（1年、3年、5年AUC值分别为0.783, 0.777, 0.772）均显示出良好的预测效能。
化疗药物敏感性分析
基于GDSC数据库的转录组预测分析显示，免疫排斥表型（Cluster 2）对5-氟尿嘧啶、多西他赛、紫杉醇、吉西他滨和拉帕替尼等多种化疗和靶向药物的预测IC50值均显著高于其他亚型，表现出广泛的化学耐药倾向。而顺铂的敏感性在组间无显著差异。
组织病理学验证：FMR1表达与免疫排斥表型空间耦合
通过CD8免疫组化染色，将胃癌标本分为免疫沙漠、免疫排斥和免疫炎症三种表型。在免疫排斥样本中，CD8+T细胞密集聚集在肿瘤-基质界面，但极少浸润至肿瘤实质内。利用连续切片和多重免疫荧光染色发现，免疫排斥表型的肿瘤细胞呈现弥漫性、强阳性的FMR1蛋白表达，且其表达空间上与CD8+T细胞的围肿瘤阻滞现象高度一致。半定量统计分析证实，FMR1表达强度与免疫排斥表型呈显著正相关。这从组织病理学层面证实了FMR1的异常积累是免疫排斥微环境的标志性分子特征。
FMR1与FTO相关联并通过MG132敏感通路影响FTO蛋白周转
生物信息学分析显示，在胃癌组织中FMR1与FTO的mRNA水平呈显著正相关。蛋白质印迹（Western Blot）证实，FMR1在多种胃癌细胞系中高表达。在胃癌细胞系NCI-N87中敲低FMR1后，FTO的蛋白水平显著下降。环己酰亚胺（CHX）追踪实验表明，FMR1敲低显著缩短了FTO蛋白的半衰期。蛋白酶体抑制剂MG132处理能够逆转由FMR1敲低引起的FTO蛋白减少，提示FMR1通过蛋白酶体途径保护FTO免于降解。免疫共沉淀（Co-IP）实验表明，Flag标签的FMR1能够特异性下拉内源性FTO蛋白，提示两者在蛋白水平存在相互作用。分子对接和动力学模拟为两者的结构兼容性和复合物稳定性提供了支持性证据。这些数据共同支持了一个模型：FMR1可能通过一种翻译后调控机制，稳定FTO蛋白，维持其在细胞内的丰度。
讨论与结论
本研究通过多组学整合，系统识别了胃癌中由FMR1-FTO轴过度激活驱动的“免疫排斥”表型。空间转录组学数据直观揭示了m6A调控网络活性在肿瘤巢特异性升高，并与CAF屏障的空间耦合。基于m6A调控因子的分型成功区分了具有不同免疫和基质特征的亚型，其中排斥表型对ICI预测应答差且预后不良。本研究的核心创新在于揭示了FMR1调控FTO蛋白稳定性的非经典机制。传统上被认为是RNA结合蛋白的FMR1，可能发挥分子伴侣或支架蛋白的功能，通过蛋白酶体依赖的途径减少FTO的周转，从而在免疫排斥表型中维持高水平的FTO蛋白。在全局激活的m6A调控网络中，被稳定的FTO更可能作为选择性“微调器”，去甲基化特定与基质重塑和免疫逃逸相关的转录本，而非全局擦除m6A标记，从而促进CAF活化和胶原沉积，最终驱动免疫排斥。FMR1-FTO轴代表了破坏基质免疫屏障、缓解免疫排斥并提高免疫治疗敏感性的潜在候选靶点。未来的研究需要在体内模型中进行功能验证，并利用全转录组m6A测序等技术阐明其下游特异性靶标。
