《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Temporal dynamics of gut microbiota and virome in preterm infants: insights from longitudinal metagenomic analysis
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本研究采用宏基因组鸟枪法测序与共现网络分析，对12名早产儿出生后14天和28天的肠道病毒组和细菌群落进行纵向表征，揭示了微生物定植的动态模式，识别了与临床参数相关的关键细菌和噬菌体。研究旨在阐明肠道噬菌体、细菌群落与临床变量之间的相互作用，以发现与健康结局相关的潜在微生物生物标志物，为理解早产儿早期肠道微生物生态系统的发展提供了初步见解。
引言：早产儿肠道微生物生态系统研究的重要性
早产（妊娠<37周）约占全球活产儿的11%。由于免疫系统和胃肠功能发育不成熟，早产儿对健康并发症的易感性增高。肠道菌群作为一个复杂的共生微生物生态系统，在新生儿发育中通过支持营养吸收、免疫功能和病原体抵抗等机制发挥关键的调节作用。尽管越来越多的证据强调了肠道菌群在早产儿健康和发育中的关键作用，但我们对于出生后早期细菌和病毒组分的时间演变的认知仍存在显著差距。被称为病毒组的病毒组分，与细菌微生物群一起，在调节肠道微生物生态系统中扮演着重要角色。阐明这些组分如何随时间演变，对于理解它们对早产儿健康结局的影响至关重要。近年来宏基因组测序技术的进步，使得对微生物群落组成、结构和动力学进行前所未有的深入剖析成为可能。
本研究对12名早产儿队列的肠道菌群和病毒组进行了全面的纵向调查，在出生后14天和28天系统性地收集样本。通过利用高通量测序技术，我们在这一关键的早期发育窗口内描述了微生物定植模式的动态变化，旨在识别随时间推移控制微生物群落组装和进化轨迹的关键因素。我们的研究试图确定围产期和新生儿变量（如抗生素暴露、喂养方式和分娩方式）如何调节肠道细菌和病毒种群的组成动态和演替模式。这些发现有望为针对早期肠道菌群调控的精准干预措施开发提供信息。通过阐明微生物群落组装和稳定性的核心决定因素，我们可以设计策略来培育具有恢复力、促进健康的微生物群，从而优化这一高风险人群的临床结局。
研究结果概览
本研究整合了从早产儿两个产后时间点收集的24个宏基因组和病毒宏基因组测序数据集。在对低质量读长进行过滤后，我们获得了总计41亿条高质量读长。通过去除潜在的人类DNA污染，宏基因组数据集保留了17亿条宿主清洁读长，而病毒宏基因组数据集则获得了2.4亿条宿主清洁读长。每个样本独立组装生成了样本特异性的重叠群。
微生物群落结构分析
为了表征早产儿肠道微生物组的分类学组成，我们使用Kraken和Bracken对宏基因组读长进行了注释。对病毒种群的分析表明，注释的病毒组绝大多数由属于尾噬菌体目(Caudovirales)的Uroviricota门的病毒组成，其中包括感染葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)和肠杆菌(Enterobacter)等细菌宿主的噬菌体。识别的关键物种包括金黄色葡萄球菌噬菌体StB20、粪肠球菌病毒FL3和链球菌噬菌体YMC-2011。然而，由于当前病毒参考数据库的限制，一部分病毒读长仍未被分类。
比较14天和28天组之间的细菌物种组成揭示了明显的分布差异。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的相对丰度在14天时显著较高，而粪肠球菌(Enterococcus faecalis)在28天时显著更高。病毒群落相对丰度方面，从14天到28天，葡萄球菌噬菌体显著减少，而肠球菌噬菌体则普遍增加。链球菌噬菌体在维持平衡的肠道菌群、防止细菌过度生长方面起着关键作用。
微生物群落多样性的变化
分析揭示了出生后14天和28天时间点之间细菌和病毒群落组成的明显差异。使用香农(Shannon)指数评估的Alpha多样性显示，28天时细菌群落的Alpha多样性显著高于14天。病毒群落在科和物种水平上显示出Alpha多样性增加的非显著趋势。基于布雷-柯蒂斯(Bray-Curtis)相异性和加权UniFrac距离的Beta多样性分析并未揭示两个时间点之间细菌或病毒群落存在统计学显著差异。然而，基于物种水平相对丰度的主成分分析(PCA)突显了组间细菌和病毒群落的结构差异，表现为样本的明显聚类模式。总体而言，从出生后14天到28天，微生物群落组成发生了显著变化。
组间微生物组成相对丰度分析
为了检查微生物物种的分布模式和相对丰度，我们量化了本研究中组间和组内比较中共有和独特的细菌和病毒物种。细菌物种花图显示，A组包含22个共有物种，而B组则包含43个共有物种。病毒物种组成分析表明，A组中共有物种数量超过独有物种，而B组中独有物种数量超过共有物种。这些发现表明，早产儿肠道菌群中细菌群落的相对丰度随时间推移保持高度稳定。细菌多样性变化的主要驱动因素被确定为发育过程中细菌分类群相对丰度的显著波动。相反，病毒群落在组间和组内均表现出显著变异性，其特征是具有组/样本特异的病毒物种以及共有成员。在14天和28天样本之间共享的病毒物种包括感染革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的物种。它们的持续存在表明在维持核心肠道微生物组功能方面发挥着重要作用。我们根据物种在组间共享和独特的相对丰度进行排名，并选择排名前10的物种进行聚类分析。组间的微生物丰度差异表明，在这些时间点上，细菌和病毒群落具有相对稳定性，尽管需要更密集的采样来确认纵向趋势。然而，丰度结构的显著变化很可能导致了组间的多样性变化。这些结果支持了早期肠道微生物逐渐对内部/外部影响做出反应，从而改变细菌/病毒群落流行率的观点。
14天和28天早产儿肠道菌群的组成与功能
早产儿的肠道菌群在早期发育过程中经历动态变化。为了研究这些变化，我们分析了14天和28天产后时间点早产儿肠道菌群中细菌和病毒物种的相对丰度和多样性。观察到了显著的变化，包括葡萄球菌属物种流行率的降低，特别是表皮葡萄球菌相对丰度的显著下降，以及粪肠球菌丰度在28天时相比14天显著增加。这些变化可能归因于抗生素治疗、潜在的益生菌补充等因素。例如，基于鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的益生菌已被证明可以增强微生物多样性，同时降低肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和葡萄球菌科(Staphylococcaceae)的丰度，从而促进更健康的肠道菌群。观察到的粪肠球菌增加可能反映了其在早产儿肠道中作为机会性定植者的作用。鉴于微生物群和免疫系统发育不成熟，它的存在可能代表了微生物演替的一个自然阶段。关于病毒群落，我们观察到葡萄球菌和肠球菌相关噬菌体在14天和28天之间的相对丰度发生变化，反映了其细菌宿主种群的波动。这些发现强调了肠道菌群内动态的噬菌体-细菌相互作用。配对t检验证实了病毒和细菌丰度在时间上具有统计学显著性的变化。这些结果突显了早产儿微生物和病毒群落随年龄的演变。
为了进一步探索细菌和病毒群落之间的功能差异，我们进行了KEGG通路富集分析。在21个显著富集的通路中，与磷酸转移酶系统(PTS)和淀粉/蔗糖代谢相关的通路在28天时占主导地位，表明了对膳食碳水化合物利用的适应。相比之下，金黄色葡萄球菌感染通路在两个时间点都保持较低水平。碳水化合物活性酶(CAZymes)的功能分析揭示了微生物代谢活性的年龄依赖性变化：辅助活性(AA)、糖基转移酶(GT)、碳水化合物酯酶(CE)和碳水化合物结合模块(CBM)在14天时占主导，而糖苷水解酶(GH)和多糖裂解酶(PL)在28天时变得更加普遍。这些发现表明碳水化合物代谢的发展变化，可能影响了成熟肠道中复杂碳水化合物的降解和微生物生态学。
病毒群落功能差异和噬菌体特征分析
为了更好地表征14天和28天产后时间点早产儿病毒群落相对丰度的功能差异，我们应用线性判别分析效应量(LEfSe)来识别与微生物变化相关的显著功能生物标志物。LEfSe结果显示，抗菌素耐药性和阳离子抗菌肽(CAMP)耐药性通路在14天时显著富集，而淀粉/蔗糖代谢、PTS、碳水化合物代谢和能量代谢通路在28天时占主导地位。这些发现与细菌群落功能趋势相关，表明辅助代谢基因(AMGs)可能介导了这些变化。我们检查了14天和28天产后时期的噬菌体感染性模式，发现与14天相比，28天时温和噬菌体的比例更高。这表明在此期间温和噬菌体流行率存在时间性增加。尽管病毒载量低和样本量有限阻碍了获得统计学显著的p值，但组间中位值的差异是明显的。
噬菌体作为在细菌宿主内复制的病毒，通常通过AMGs影响宿主代谢。这些AMGs调节细菌代谢途径以支持噬菌体复制和增殖。我们根据其参与的代谢过程对两个时间点的AMGs进行了分类。两组均显示氨基酸代谢中的AMGs活性占主导，包括编码氨基酸合成、降解或运输酶的基因。在28天时，碳水化合物、能量代谢以及辅因子/维生素通路显著增加。值得注意的是，核苷酸代谢和芳香族化合物代谢出现在28天产后噬菌体AMGs中。相比之下，萜类/聚酮化合物代谢在14天产后噬菌体AMGs中占主导。更引人注目的是，与14天相比，大多数噬菌体AMG类别在28天时丰度增加。这些发现突显了出生后第一个月内早产儿肠道菌群中病毒功能谱、噬菌体感染性和AMG活性的动态变化。观察到的变化反映了病毒和细菌群落对不断变化的微生物环境和代谢需求的适应性反应。
噬菌体-细菌相互作用网络及细菌-临床相关性分析
预测噬菌体与临床变量之间的相互作用对于增进我们对微生物动力学及其对健康结局影响的理解至关重要。噬菌体通过特异性感染和裂解细菌宿主来调节微生物群落。为了探索这些相互作用，我们构建了一个微生物相互作用网络，将早产儿的临床数据与细菌物种联系起来。罗氏肠杆菌(Enterobacter roggenkampii)网络与每日奶摄入量（出生后14-28天）和开始经口喂养的时间显示出最强的关联。正如预期的那样，出生后四周内的抗生素使用与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)显示出强关联。网络分析揭示了微生物物种与临床参数之间的显著关联：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)与出生后四周的抗生素使用时间和类型显示出最强的连接性，而肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)与入院体温显示出较弱但仍具有统计学显著性的相关性。此外，排名前20物种的热图突出了与临床变量相关的关键细菌分类群，包括奶摄入量和恢复出生体重所需的时间。该分析阐明了早产儿微生物群落与临床结局之间复杂的相互作用。
讨论：早产儿早期肠道微生物动态的意义与展望
肠道微生物群内部的相互作用显著影响宿主生理、发育和免疫功能。建立稳定的新生儿肠道细菌微生物组至关重要，因为它可能塑造成人微生物组的组成，并影响长期健康结局。早产儿面临着肠道微生态不稳定、微生物定植延迟和微生物多样性减少等挑战，从而增加了疾病易感性。然而，早产儿肠道菌群的产后演替模式仍鲜为人知。在这里，我们全面表征了12名早产儿在出生后14天和28天时间点粪便样本中的病毒组和细菌群落，以定义产后微生物定植动态。我们的研究揭示了动态微生物定植过程及其对早产儿健康的潜在影响的重要见解。重要的是，本研究被设计为一项探索性分析，旨在描述早产儿细菌和病毒群落动力学的早期时间模式。因此，研究结果应被视为假设生成，为未来的靶向和机制研究奠定基础，而不是确立明确的因果关系。
我们观察到，出生后14天和28天之间，病毒物种组成在组间和组内存在显著差异。这些变化在特定噬菌体的相对丰度上最为明显。例如，葡萄球菌噬菌体在14天时丰度较高，但在28天时显著下降，而肠球菌噬菌体在此期间增加。这种转变表明，婴儿肠道病毒组对细菌种群变化做出动态响应，这与先前关于噬菌体在早产儿肠道菌群中持续存在的研究一致。此外，粪肠球菌和表皮葡萄球菌等细菌物种的相对丰度下降，而艰难梭菌(Clostridioides difficile)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)保持稳定存在，支持了它们作为早期肠道菌群核心成员的作用。
病毒组对细菌变化的反应凸显了细菌和噬菌体之间复杂的相互作用。观察到的葡萄球菌噬菌体下降和肠球菌噬菌体增加可能反映了噬菌体介导的细菌种群调节，强调了微生物稳态以及噬菌体捕食在塑造早产儿肠道群落结构中的作用。此外，肠-肺轴对于理解肠道菌群失调如何影响全身炎症和肺部发育至关重要。艰难梭菌等病原体的持续存在可能有助于影响肺部健康的炎症过程，这对于具有高呼吸道并发症风险的早产儿来说是一个值得关注的问题。这些发现强调了早产儿病毒组复杂的个体化性质，不同的噬菌体种群与细菌物种相互作用，以响应环境和临床因素。
值得注意的是，粪肠球菌和表皮葡萄球菌在14天到28天之间的相对丰度显著下降。91.67%的样本表现出独特的物种丰富度降低，而Sample12在28天时含有109个独特的细菌物种。我们进行了质量控制检查以排除技术假象。对这种异常现象的一个合理解释是由饮食、医疗干预或环境暴露等外部因素驱动的瞬时细菌定植。然而，需要额外的生物学重复和详细的元数据来确认此异常值的根本原因。
艰难梭菌和肺炎克雷伯菌的相对丰度在14天和28天时间点之间保持稳定，表明它们作为早期肠道菌群核心成员的潜在作用。尽管如此，早产儿肠道微生物组的动态特性，其特征是持续成熟和环境影响，需要更多时间点进一步研究以确认这些物种的长期稳定性。噬菌体丰度的显著样本间变异、有限的共享物种以及独特的噬菌体分类群的高流行率模式，与已建立的病毒组研究，特别是肠道菌群研究结果一致。噬菌体群落高度个体化，受宿主微生物组组成的强烈塑造。我们的研究结果证实了先前的证据，即葡萄球菌噬菌体通过裂解葡萄球菌属物种来调节细菌种群，从而防止过度生长并维持微生物稳态。我们的样本中存在大量独特的噬菌体可能反映了短暂的相互作用或条件。观察到的独特噬菌体物种的高比例也可能源于当前病毒组数据库的技术限制，因为许多噬菌体仍未得到表征。肠道环境表现出显著的个体间变异，受饮食、抗生素暴露、分娩方式和免疫状态等因素影响，所有这些都导致了不同的噬菌体组成。我们的结果突显了肠道噬菌体种群高度动态、个性化和多样化的性质，与当前病毒组研究范式一致。
在14天和28天出生后肠道菌群中分析的KEGG通路中，与碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢相关的通路在时间点之间显示出显著差异，反映了随着肠道菌群成熟，微生物活性的动态变化。相比之下，感染相关通路，如金黄色葡萄球菌感染通路，丰度持续较低且无显著变化，表明在早产儿微生物定植的这个阶段贡献最小。
早产儿不成熟的肠道和皮肤屏障，加上其免疫系统发育不成熟，可能会增加对病毒感染的易感性。病毒感染可能使他们易患呼吸道疾病、胃肠道疾病和其他并发症，从而增加医疗风险。我们的研究揭示了14天和28天早产儿之间病毒群落功能谱和噬菌体特征的显著差异。这些发现表明，早产儿肠道菌群可能经历失调，进一步增加了感染风险。
最近的一项研究表明，生命早期的病毒定植是一个渐进的过程。初始阶段涉及先锋细菌激活噬菌体，随后是病毒感染人类细胞的定植。开始母乳喂养的时间是这一过程的主要决定因素，早产儿通常比足月新生儿开始得晚。此外，个体相关性和年龄显著影响病毒多样性，而环境暴露仍然是影响病毒丰度的关键因素。我们观察到，与出生后14天相比，28天时肠道病毒丰富度增加。然而，未检测到每个样本独特病毒物种的显著增加，我们假设这可能反映了个体间差异。值得注意的是，早产儿肠道病毒组间存在高度个体间差异，而时间上的个体内差异相对较低。一项追踪12名婴儿出生后第一年肠道细菌发育的纵向研究揭示，微生物群落从子宫定植开始就持续与内部和外部因素相互作用。这些相互作用驱动了门水平相对丰度的波动，导致非线性的微生物演替。众所周知，病毒会操纵宿主细胞过程以增强复制和传播。除了复制和组装的核心基因外，一些病毒还编码AMGs，以调节宿主代谢，为增殖创造有利环境。我们假设，与碳水化合物代谢和磷酸转移酶系统(PTS)相关的AMGs可能增强粪肠球菌等细菌宿主的营养利用，为它们提供定植优势。通过分析噬菌体和细菌的代谢谱，我们识别了塑造噬菌体-细菌关系的关键途径和相互作用。我们的网络分析强调氨基酸代谢是噬菌体-细菌相互作用的关键驱动因素，为这些复杂的微生物动力学提供了临床见解。
噬菌体是特异性感染细菌的病毒，也可能在早产儿肠道中发挥重要作用。研究表明，早产儿肠道中的噬菌体群落与足月儿不同，这可能是由于不成熟的免疫系统和抗生素暴露等因素造成的。我们的研究结果表明细菌和病毒相对丰度存在动态的时间变化，包括葡萄球菌相关噬菌体的减少和肠球菌相关噬菌体在14天到28天之间的增加，这与微生物组成演变同步。这些趋势表明噬菌体群落可能对细菌种群变化做出反应，但需要功能研究来阐明适应机制。例如，粪肠球菌和表皮葡萄球菌的下降以及它们各自噬菌体的增加意味着噬菌体捕食可能调节细菌动力学。这种相互作用对于理解肠道菌群如何维持稳态和适应环境扰动至关重要，特别是在脆弱的早产儿肠道生态系统中。除了组成变化，肠道菌群还发生了显著的功能重组。粪肠球菌和表皮葡萄球菌的减少以及肠球菌噬菌体的增加可能表明它们在营养代谢、免疫调节和屏障功能中的作用发生了变化。值得注意的是，产丁酸梭菌(Clostridium butyricum)（一种产丁酸物种）的增加表明向更有利于肠道健康和免疫成熟的有益代谢谱转变。这些动态的细菌和病毒变化强调了平衡的肠道菌群对早产儿健康的重要性。
本研究仅限于两个时间点，阻碍了确定观察到的28天时温
