《Frontiers in Plant Science》：Enhanced morphological and physiological responses of micro-propagated cassava through arbuscular mycorrhizal fungus inoculation
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本篇研究揭示了丛枝菌根真菌（AMF）接种在木薯（cassava）组培苗驯化与后期适应阶段的关键作用。通过比较接种与未接种处理，研究证实AMF能显著提升植株株高、茎粗、叶片数及生物量，并改善氮利用效率（NUE）。尤其在水分子缺条件下，AMF接种虽未增加生物量，但通过增强根系殖民（root colonization）、调节碳氮稳定同位素（δ13C、δ15N）特征与叶片叶绿素含量，提升了植株的抗逆潜力。研究指出，AMF的促生效应可能导致组织氮稀释，强调在AMF应用中需配合合理的氮管理。
1 引言
木薯（Manihot esculenta Crantz）是一种重要的块根作物，广泛种植于热带与亚热带地区。传统上，木薯通过茎段扦插繁殖，但此方式易传播病害。利用植物组织培养技术进行微繁殖，可高效生产大量遗传性状一致且无病虫害的植株，是一种优良的替代方案。然而，微繁殖技术的一个主要限制是离体培养植株在从实验室转移到温室的过程中及其后，具有高死亡率，这成为其广泛应用的重大障碍。即使在最佳条件下，通常也只有约78%的木薯组培苗能在驯化阶段存活。死亡率主要归因于根系发育不足和光合能力低下，两者共同限制了植株的生长与定植。驯化和驯化后是两个重要的阶段，影响着植株能否成功过渡。在驯化阶段，植株被移栽到泥炭藓或珍珠岩基质中，通常配合使用塑料罩以保持高湿度和限制水分流失。驯化是一个关键阶段，因为组培苗表现出较弱的气孔控制能力，同时表皮水分流失高，使其对非生物胁迫高度敏感。早期死亡通常归因于基质湿度变化过大或水分过多、营养条件欠佳，这些因素共同导致植株在驯化阶段极为脆弱。然而，与驯化后阶段相关的研究仍然匮乏。
驯化后，木薯组培苗将进入完全独立的自养生长阶段，在此期间，它们可能受到环境胁迫的负面影响，其中水分亏缺是影响它们的主要问题之一。随着木薯种植区的气候不稳定性增加以及种植向更干旱的地区扩展，了解植株在驯化后阶段对干旱的响应变得越来越重要。提高木薯在此阶段的存活率，不仅有助于提升微繁殖效率，也能支持在不断变化的气候条件下的木薯生产。
干旱胁迫在驯化后阶段会通过破坏光合作用和碳代谢来阻碍植株的正常生长和发育。为应对水分亏缺，植株会发生形态和生理变化，包括气孔关闭、CO2吸收减少以及光合活性下降。这些生理限制是导致植株定植和生产力降低的原因。碳同位素值（δ13C）整合了气孔导度和碳固定的长期变化，为评估植株对水分可利用性的响应提供了有用的指标。虽然δ13C的概念在田间种植的木薯应对干旱胁迫方面已被广泛探讨，但其在温室条件下微繁殖木薯中的作用仍有待探索。
丛枝菌根真菌（AMF）为增加驯化后阶段植株在水分稀缺条件下的存活机会提供了一种潜在途径。通过与根系共生，AMF增强了磷和其他矿质元素的吸收，并可能影响植物生长调节剂，从而加强植株的定植和整体胁迫耐受性。尽管其他植物促生微生物（PGPM），如根际细菌或内生真菌，已在木薯中得到评估，但AMF的主要相关性在于其直接与增强水分获取以及由此产生的干旱适应能力相关。AMF通过优化根系发育、调节气孔功能和养分吸收，来缓解移栽胁迫和极端环境变化。AMF辅助驯化已在其他微繁殖作物如草莓和胡椒中得到广泛研究，但在木薯中的研究仍然很少。尽管改善驯化成功率已被强调，但关于微繁殖木薯在随后的关键田间定植阶段——驯化后阶段——如何响应环境胁迫，人们知之甚少。
2 材料与方法
实验采用2×2×2全因子随机区组设计，包含三个因素：(1) 两个AMF接种水平——接种不规则根孢囊霉（Rhizophagus irregularis，+接种物）和未接种对照（-接种物）；(2) 两个水分制度——充分浇水（WW，维持100%盆容量）和水分亏缺（WD）；(3) 两个木薯品种——TME 419和cv. 60444。这些处理以完全随机设计排列，4次重复，总计32个实验盆。
研究在比利时鲁汶大学的温室中进行，最大光照14小时，湿度50-60%，昼/夜温度分别为25°C和20°C。种植基质为从鲁汶Ter Munck农田采集的自然壤土与石英砂（<2mm）按3:1体积比混合而成。壤土性质为：pH 6.7，有机碳0.9%，有效磷（Olsen法）59 mg/L，全氮0.1%。
选用不规则根孢囊霉（R. irregularis）进行实验，基于其在尼日利亚木薯田间的优势地位。分离株购自美国西弗吉尼亚大学的国际（泡囊）丛枝菌根真菌保藏中心（INVAM）。AMF接种物的扩繁以木薯作为宿主植物，在温室中使用灭菌的硅石-蛭石基质（白硅砂70%，蛭石30%）进行三个月。三个月后，停止浇水一周，取出根系并切成小于5毫米的小段，然后与整个硅石-蛭石基质混合。接种物（根系和基质的混合物）除接种的不规则根孢囊霉外不含其他土壤微生物群，在使用前于4°C储存数周。
木薯品种cv. 604444和TME-419的离体再生组培苗由列日大学Gembloux Agro-Bio Tech提供。为获得足够数量的组培苗，从离体再生组培苗上制备节段（5–10 cm），并按照Bull等人（2009）的方法，在木薯基本离体培养基（CBM）上进行继代培养，培养基中添加20 g/L蔗糖和1 mL 2mM CuSO4，使用无菌一次性塑料罐。培养基pH调至5.8，每升培养基添加2.5 g L?1Phytagel?（Sigma-Aldrich?）用于凝胶化。培养基根据Murashige和Skoog（1962）及Bull等人（2009）的方案，在120°C、115 kPa下高压灭菌1小时。外植体在24±2°C、40±5 μmol m?2s?1辐照度、16小时光周期下培养。培养4周后，从罐中取出大小均匀、根系发育良好的组培苗，洗净根系，立即移栽到装有相同非灭菌壤土-砂混合物（3:1，v/v）的聚丙烯托盘中。接种处理包括向每个种植穴添加5克AMF接种物（根系和土壤基质的混合物）。为防止定植率过低，目标为每个种植穴达到500个孢子。对照植株未接受灭菌接种物，因为实验旨在模拟现实条件。鉴于使用的自然土壤含有有机质，且所有处理都提供了充足的养分。土壤的全氮（0.083%）、Olsen磷（2.54 mg/kg）和总有机碳（<0.3%）含量均较低。可交换阳离子含量也较低：钙（1.88 meq/100 g）、钾（0.147 meq/100 g）、镁（3.34 meq/100 g）、钠（0.113 meq/100 g）。按5克接种物施于5公斤种植基质（0.1% w/w）的施用率，接种物的营养贡献可忽略不计，这证明其作为AMF繁殖体的载体是合理的，且不影响土壤肥力，因此实验中不需要灭菌接种物。
装有组培苗的盆被放置在塑料托盘上，向托盘中加水直至盆部分浸没，通过毛细作用使基质饱和。一旦基质完全饱和，将盆从水中取出。之后，在鲁汶大学的温室中，用透明盖子完全覆盖组培苗，光照12小时，相对湿度60%。一周后，使用洗瓶以细雾形式喷施60 mL霍格兰营养液。组培苗在温室中再保持半开盖状态一周。记录每株植物喷施的霍格兰营养液总体积，用于后续氮利用效率（NUE）计算。
3 结果
3.1 AMF定植
收获时，+接种物木薯组培苗的根系清晰显示出AMF菌丝的高增殖。未接种植株显示出可忽略的定植（<5%），仅包含菌丝，证实土壤中背景AMF存在极少。与未接种植株相比，菌丝、泡囊和丛枝分别增加了59.7%、90.1%和65.4%。水分亏缺显著减少了泡囊和丛枝的存在，分别降低了50.2%和74.9%，但不影响菌丝。品种间泡囊和丛枝形成存在差异；cv. 604444比TME 419具有更多的泡囊，而TME 419比cv. 60444具有更多的丛枝。此外，存在显著的接种×水分制度×品种三向交互作用，例如在充分浇水条件下，接种使cv. 60444的菌丝数量比充分浇水未接种植株的菌丝增加了61.5%。在水分亏缺条件下，接种使cv. 60444和TME 419的菌丝数量分别比未对照植株增加了39.3%和67.8%。
3.2 驯化阶段的植株生长响应
在驯化阶段初期（移栽后4-8周），与未灭菌土壤中的未接种植株相比，AMF接种使株高、茎粗和叶片数分别增加了61%、50%和57%。木薯品种无显著影响，接种与品种间无显著交互作用。
3.3 水分胁迫引入后驯化后阶段的植株生长响应
在引入水分亏缺后的第一周，接种显著改善了株高、茎质量和绿叶数，分别增加了46.0%、29.4%和24.0%。在引入水分亏缺后的第二周，接种显著增加了株高和茎粗，分别增加了25.5%和29.0%，但绿叶数不受影响。这两周内，水分制度和品种对上述生长参数无显著影响。株高存在显著的接种×水分制度交互作用。水分亏缺下的接种植株比水分亏缺下的未接种植株高14%，而在充分浇水条件下，接种植株比未接种植株高48.6%。
接种植株的气孔导度在水分亏缺引入后第一周比未接种植株低20%。水分制度在两周内均显著影响气孔导度。在水分亏缺第一周，气孔导度从充分浇水下的557.3 mmol m?2s?1下降至水分亏缺下的407.1 mmol m?2s?1。在水分亏缺第二周，这种下降加剧，充分浇水下为437.20 mmol m?2s?1，水分亏缺下为56.1 mmol m?2s?1，差异达87.1%。
3.4 收获时植株生物量积累和叶片叶绿素含量
在两个品种中，水分亏缺使根生物量和地上部生物量分别显著降低达35.7%和45.0%。AMF接种对木薯生物量生产有显著影响，使地上部和根生物量分别增加63%和68%。地上部生物量无显著的接种×水分制度交互作用，但根生物量存在显著交互作用。充分浇水木薯植株的根生物量比相同水分条件下未接种植株增加了54.84%。接种和未接种的水分亏缺植株的根生物量分别比接种的充分浇水植株低56.0%和58.0%。地上部生物量和根生物量与总根定植率呈显著正相关。
接种AMF的植株，其叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别增加了21.6%、25.5%和24.9%。不同水分制度和木薯品种无影响，所有测试因子间无显著交互作用。
3.5 氮利用效率
微繁殖木薯的氮利用效率在接种时显著提高了44.2%。充分浇水的组培苗比经受水分亏缺的植株具有更高的NUE。品种间NUE无显著差异。然而，存在显著的接种×水分制度交互作用：充分浇水接种组培苗的NUE比未接种的充分浇水植株高54.4%，而处于水分亏缺条件下的组培苗，无论是否接种，其NUE均无显著差异。
3.6 碳氮稳定同位素、组织碳氮百分比、碳氮比
接种对木薯组培苗最新完全展开叶的δ13C无显著影响。然而，存在显著的接种×水分制度交互作用。无论是否接种，水分亏缺下的植株与接种和未接种的充分浇水植株相比，其δ13C值更低（更负）。植物组织中的碳浓度对任何处理均无响应，且无显著交互作用。组织碳含量与总根定植率无显著相关。接种使植物组织中的氮浓度比未接种组培苗显著降低了26.9%。水分制度和品种对氮浓度无显著影响，且无显著交互作用。氮浓度与总根定植率呈负相关。微繁殖木薯植株最新完全展开叶中的δ15N比未接种植株低12.97%。所有其他处理和交互作用均不显著。δ15N与NUE呈负相关。
接种使碳氮比（C:N）比未接种组培苗增加了21.5%。TME 419的碳氮比高于cv. 60444。存在显著的接种×水分制度交互作用。接种的充分浇水植株的碳氮比最高。接种的充分浇水植株的碳氮比比未接种的充分浇水植株高28.0%，比接种和未接种的水分亏缺植株分别高18.8%和29.6%。碳氮比与定植强度呈正相关。
3.7 木薯形态和生理响应于接种和水分胁迫的混合数据因子分析
木薯组培苗的氮利用效率、地上生物量、碳氮比、地下生物量、全氮浓度、根定植百分比、叶片数和茎粗是混合数据因子分析第一主轴的主要贡献因子，而总叶绿素、气孔导度、δ13C和δ15N则是第二主轴的主要相关因子。分析进一步表明，叶片数、气孔导度、总碳百分比和泡囊均呈正相关，但与叶片叶绿素含量呈反比关系。植物生长、地上和地下生物量、菌丝、丛枝、总根定植百分比、δ13C和碳氮比均呈正相关。然而，所有这些参数与δ15N和全氮百分比均呈负相关。分组分析显示，接种与未接种AMF的组别存在差异，品种响应相似，而水分制度也导致了组间区分。
4 讨论
这项工作提供了关于在现实非灭菌土壤条件下，从枝菌根真菌定植的微繁殖木薯在驯化和驯化后阶段对水分胁迫的形态和生理调整的新信息。实验清楚地证明，接种商业不规则根孢囊霉增强了微繁殖木薯的生长。AMF支持植物生长，但在充分浇水条件下的益处远大于水分亏缺条件下。此外，研究揭示，接受给定接种物的微繁殖木薯，由于生物量生产增强刺激了氮利用效率提高，其氮浓度较低。
4.1 菌根定植与组培苗生长
AMF定植植物根系的速度是宿主植物与真菌之间成功共生参与的指标。在接种的组培苗中，观察到AMF不仅通过菌丝定植根系，还形成了泡囊和丛枝。离体转移5周后估计的总根定植率为81%，其中60%为菌丝，14%为泡囊，7%为丛枝。三种结构的存在表明功能性共生关联的成功形成，因为丛枝是允许养分交换的主要结构，而泡囊则作为繁殖器官并储存碳水化合物。由于先前研究表明商业AMF接种物可能并不总是与宿主植物相容或可能无法与本地土壤AMF群落竞争，因此所发现的定植是一个关键结果。我们还观察到，本实验中使用的非灭菌自然土壤中的本地AMF物种定植了33%的木薯根系。这表明所用土壤含有相容的AMF，但由于孢子密度和生物地理因素差异，其定植效果不如商业产品。
在驯化阶段结束时，发现接种的组培苗更高、茎粗更大、绿叶更多。在驯化阶段观察到的生长增强在整个驯化后期得以持续。微繁殖木薯组培苗的生长受到较高根定植率的积极影响，这与在微繁殖草莓植株中报告的效应相当。在两个品种中发现的类似AMF定植响应表明，cv. 60444和TME 419都与不规则根孢囊霉具有相似的相容性。需要进行更多研究以确定接种不规则根孢囊霉对木薯在驯化期间和之后生长的有益效应是否也能在其他木薯品种中观察到，以及其他AMF物种是否能引起类似的积极效应，因为作物对接种的响应取决于AMF物种和作物物种。
4.2 AMF对不同水分条件下木薯生物量积累的影响
在充分浇水条件下，AMF接种使植物生物量翻倍，表明当水分不受限制时，AMF增强了养分吸收。通常，AMF接种对植物生物量的效应大小随AMF定植率增加而增加，因为即使在不利条件下，AMF菌丝也能通过增加根表面积来帮助宿主植物，使其能够获取水分、微量和大量营养素。虽然据报道，在一些微繁殖系统中，AMF甚至在水分亏缺下也能增强生物量生产；例如，在短期断水后，球囊霉属增加了微繁殖草莓的地上部和生物量。然而，在我们的研究中，在水分亏缺条件下，AMF接种并未转化为生物量增加，这表明干旱限制了共生关系的功能益处，并且AMF介导的木薯生长增强强烈依赖于充足的水分可利用性。
4.3 AMF接种对不同水分条件下叶片气孔导度和叶绿素含量的影响
水分亏缺在水分亏缺的两周内持续降低了组培苗的气孔导度。事实上，到第二周，气孔导度急剧下降。与预期相反，定植率增加并未帮助缓解接种植株因气孔导度降低而受到的胁迫。这一发现与一些报告相矛盾，这些报告表明AMF可以在水分亏缺条件下增加各种植物的气孔导度。然而，我们的结果与Pe?a Venegas等人（2021）的结果一致，他们表明接种不同不规则根孢囊霉分离株的木薯气孔导度存在差异，甚至在干旱条件下接种植株的气孔导度可能更低。
叶绿素数量的差异可能表明植物光合能力发生了潜在的功能性变化，因为叶绿素的合成取决于植物的矿质营养。我们发现，接种AMF使微繁殖木薯的总叶片叶绿素含量比未接种植株提高了25%。然而，叶绿素含量对干旱的响应与充分浇水条件下相同。这表明，本研究中接种后观察到的叶绿素含量增加并非如Bouskout等人（2022）所建议的干旱耐受机制，而是接种处理中观察到的生长增加的结果。这与Estrada-Luna和Davies（2003）的发现一致，他们记录了接种AMF的辣椒在驯化后阶段叶绿素大幅增加。此外，Liu等人（2015）和Balestrini等人（2020）证明，菌根植物通常比非菌根植物具有更强的光合能力。AMF定植的植物可以通过蒸腾速率、光合速率和叶绿素含量的增加来体验这些益处。
4.4 AMF接种对微繁殖木薯在不同水分条件下碳氮稳定同位素的影响
我们最初预计，断水会降低气孔导度，从而导致更高（负值更小）的δ13C，这是由于对13CO2的歧视减少，正如经典同位素理论所预测的那样。与这一预期相反，暴露于水分亏缺的植株表现出更负的δ13C值，无论是否接种AMF。重要的是，尽管在干旱条件下气孔导度并未一致降低，但出现了这种模式，表明本研究中δ13C的变化不能直接归因于气孔调节。δ13C与气孔导度之间缺乏对应关系，表明存在由气孔后光合作用控制（如干旱下叶肉导度和生化限制的变化）驱动的解耦。接种植株的δ15N低于未接种植株，尽管接种增加了植物生物量。接种植株氮利用效率的提高可能导致氮吸收过程中的同位素分馏减少，从而产生更低的δ15N，因为δ15N的变化可能表明植物中氮的利用率高。
4.5 菌根定植对微繁殖木薯碳氮百分比和氮利用效率的影响
AMF接种增加了根和地上部生物量，特别是在充分浇水条件下，表明碳同化和生长增强。尽管如此，与未接种植株相比，AMF接种植株表现出更低的组织氮浓度和更高的碳氮比。这种模式反映了一种经典的氮稀释效应，即随着生长加速，植物吸收的氮分布在更大的生物量库中。重要的是，组织氮浓度的这种降低发生在氮利用效率显著提高的同时，表明AMF接种植株每单位吸收的氮产生了更多的生物量。
除了生物量稀释，几种机制途径可能解释观察到的氮利用效率改善。从枝菌根真菌通过根外菌丝扩展根系的有效吸收表面积，从而获取超出根耗竭区的氮库，从而增强氮获取。AMF定植还可以改变根系结构，增加根分支和功能根长，进一步提高氮吸收效率。此外，AMF可能通过改变根际微生物群落和刺激氮矿化过程间接影响氮的可利用
