《Neuroscience Bulletin》：Microglia Pyroptosis-Derived IL-18 Drives White Matter Injury in Developing Brain following Hypothermic Hypoxia-Ischemia
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低温是公认的脑保护措施，但临床实践发现，接受深低温停循环（DHCA）手术的发育期大脑仍可能出现白质损伤，其机制不明。本文通过建立幼鼠DHCA模型和体外氧糖剥夺模型，首次阐明低温缺氧缺血诱导小胶质细胞经历GSDMD依赖性焦亡，释放IL-18，进而导致成熟少突胶质细胞死亡和轴突脱髓鞘，是白质损伤的关键机制。研究进一步发现，药物双硫仑可抑制小胶质细胞焦亡，有效减轻白质损伤。该研究为防治低温保护下残余的脑缺血损伤提供了新的潜在治疗靶点。
在复杂心脏大血管手术，特别是复杂先天性心脏病的治疗中，深低温停循环（DHCA）技术扮演着至关重要的角色。医生通过将患者的体温降至18℃左右，显著降低了大脑的氧耗和代谢率，从而在手术期间为大脑提供宝贵的“时间窗口”，以减少缺血损伤。然而，尽管低温的保护作用得到广泛认可，一个不容忽视的现实是，发育期大脑在接受DHCA手术后，仍然可能出现神经发育障碍，如运动技能差、语言发育迟缓和认知障碍。磁共振成像（MRI）已揭示，这些儿童的脑部可能发生了白质损伤。白质是中枢神经系统中负责在不同脑区间传递神经信号的关键结构，对记忆、注意力、行为和语言处理等高级认知功能至关重要。这表明，低温并不能完全阻止残余的脑缺氧缺血损伤。那么，在低温条件下，究竟是何种机制导致了白质损伤？这一问题成为临床神经保护领域亟待解决的谜题。
为了解决这一科学难题，来自上海儿童医学中心的研究团队开展了一项深入的研究。他们通过建立体外培养脑切片的低温氧糖剥夺模型和幼龄大鼠的DHCA活体模型，模拟了临床上的低温缺氧缺血条件。研究发现，在低温缺氧缺血条件下，大脑中的“免疫哨兵”——小胶质细胞，会经历一种名为“焦亡”的程序性细胞死亡。具体来说，这种死亡是由GSDMD蛋白介导的。焦亡的小胶质细胞会释放大量的炎症因子白细胞介素-18。正是这个被释放出来的IL-18，成为了后续损伤的“元凶”，它直接导致了大脑中负责制造髓鞘（神经纤维的“绝缘层”）的成熟少突胶质细胞死亡，进而引起轴突脱髓鞘，最终造成了白质损伤。更有希望的是，研究团队发现，使用药物双硫仑来抑制小胶质细胞的焦亡过程，无论是在体外还是体内模型中，都能显著减轻白质损伤。这项重要的研究成果发表在《Neuroscience Bulletin》期刊上，为理解低温条件下脑损伤的残余风险提供了全新的分子视角，并指出靶向小胶质细胞焦亡可能成为预防此类神经发育损伤的有效策略。
为开展此项研究，研究人员综合运用了多层次的实验方法。首先是模型的构建，包括利用3周龄SD大鼠脑切片建立体外低温氧糖剥夺模型，以及通过开胸手术、血管插管建立幼龄大鼠的深低温停循环活体模型，高度模拟临床手术过程。在技术层面，研究采用了单细胞RNA测序来解析胼胝体（大脑主要白质结构）中各类细胞的转录组变化，并精确定位了发生焦亡的细胞类型。分子机制研究则依赖于蛋白质印迹、实时定量PCR、酶联免疫吸附测定和细胞因子芯片阵列，系统检测了焦亡通路相关蛋白、炎症因子及NF-κB信号通路的激活情况。细胞命运的鉴定通过膜联蛋白V/碘化丙啶流式细胞术、Hoechst 33342/PI染色以及透射电子显微镜观察细胞膜孔洞实现。此外，免疫荧光染色结合共聚焦显微镜成像，以及黑金髓鞘染色、髓鞘碱性蛋白免疫荧光和透射电镜观察髓鞘超微结构（如G-比率和厚度），被用于在形态学上评估白质损伤和脱髓鞘程度。临床相关性方面，研究纳入了两名完全性肺静脉异位引流患儿的术后脑部MRI（包括T1/T2加权像、弥散张量成像和纤维束追踪成像）数据，用于分析白质损伤的影像学特征。
研究结果
1. White Matter Injury in Pediatric Patients and Weanling Rats following Hypothermic Hypoxia-ischemia
临床影像学分析发现，接受DHCA手术的患儿脑部双侧脑室旁白质出现点状损伤病灶，且白质纤维束体积和结构连接性降低，各向异性分数值在胼胝体、放射冠和半卵圆中心显著下降，表明白质存在微观结构损伤。在动物模型中，即便在18℃的深低温条件下进行氧糖剥夺，大鼠胼胝体的髓鞘碱性蛋白表达仍显著降低，透射电镜显示髓鞘变薄、G-比率升高，证实了低温无法完全阻止OGD诱导的白质损伤。流式细胞术进一步发现，OGD组胼胝体中膜联蛋白V和碘化丙啶双阳性细胞增多，提示存在焦亡样细胞死亡。
2. Hypothermic OGD Triggers Microglia Pyroptosis in Corpus Callosum
机制探索表明，低温OGD显著上调了大鼠胼胝体中NLRP3、GSDMD和cleaved CASP1的蛋白表达。单细胞RNA测序和免疫荧光染色共同揭示，Gsdmd基因的上调和GSDMD蛋白的增加几乎只局限于小胶质细胞。透射电镜直接观察到了小胶质细胞膜上因焦亡形成的孔洞。在分离培养的原代小胶质细胞中，低温OGD同样诱导了细胞膜破裂和GSDMD表达上调。这些结果综合证明，低温OGD特异性地触发了小胶质细胞的焦亡。
3. WMI is Induced by IL-18 Release Through NF-κB/GSDMD-Dependent Pyroptosis
通路分析显示，发生焦亡的小胶质细胞中NF-κB信号通路被激活，表现为p-IKBα和p-p65蛋白水平升高。抑制NF-κB可有效抑制小胶质细胞的焦亡。尽管细胞内IL-1β和IL-18的蛋白水平均升高，但细胞外灌流液中仅IL-18的水平显著增加。3D重建成像证实，IL-18主要来源于小胶质细胞内。功能实验发现，外源性IL-18（而非IL-1β）能够导致原代少突胶质细胞MBP表达下降，并在脑切片中引起轴突脱髓鞘和成熟（CC1+）少突胶质细胞数量减少，同时刺激少突胶质前体细胞增殖。这表明白质损伤是由小胶质细胞焦亡来源的IL-18所驱动。
4. DSF Alleviates Pyroptosis-Driven WMI in Weanling Rat Following Hypothermic OGD and DHCA
干预研究表明，焦亡抑制剂双硫仑处理，在体外OGD模型中能降低胼胝体内焦亡相关蛋白（NLRP3、c-CASP1、GSDMD、IL-1β、IL-18）水平，增加MBP表达，并减少小胶质细胞中的GSDMD，从而减轻脱髓鞘。在体内DHCA模型中，术前给予双硫仑同样降低了胼胝体GSDMD蛋白、血清IL-18和IL-1β水平，增加了MBP表达，并缓解了DHCA诱导的白质损伤。这证明抑制小胶质细胞焦亡具有神经保护作用。
结论与意义
本研究的核心结论是：在发育期大脑中，低温缺氧缺血会激活小胶质细胞内的NF-κB信号通路，进而触发其发生GSDMD依赖性的经典焦亡途径。焦亡的小胶质细胞释放出关键炎症因子IL-18，后者直接诱导成熟的少突胶质细胞死亡，导致轴突脱髓鞘，最终引发白质损伤。而药物双硫仑通过抑制小胶质细胞焦亡，能够在体外和体内模型中有效减轻这种损伤。
这项研究具有多重重要意义。首先，在理论上，它首次阐明了低温条件下（以DHCA为代表）发育期脑白质损伤的一个全新细胞与分子机制，将小胶质细胞焦亡及其产物IL-18置于该病理过程的核心位置，深化了对低温神经保护局限性的理解。其次，在方法学上，成功建立的幼龄大鼠开胸DHCA模型，为更贴近临床情景地研究此类脑损伤及测试干预措施提供了有力的工具。最重要的是，在临床转化层面，研究明确了小胶质细胞焦亡作为一个潜在的、可干预的治疗靶点。双硫仑作为一种已用于临床其他疾病的药物，在本研究中展现出的保护效果，为其“老药新用”、未来可能应用于预防DHCA术后神经发育障碍提供了重要的临床前证据。尽管研究样本量尤其是临床部分有限，但其揭示的机制通路为开发针对性的脑保护策略指明了新方向，有望改善接受复杂心脏手术的婴幼儿患者的长期神经发育预后。
