《npj Dementia》：A high-throughput, quantitative platform using 2D dissociated human cerebral organoids to model neuroinflammation in Alzheimer’s disease
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为了深入理解阿尔茨海默病（AD）中神经炎症的关键作用，并开发新型方法学（NAM）以评估潜在疗法，研究人员利用人脑类器官衍生的二维解离细胞（dcOrgs）平台，通过单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染模拟AD相关病理。研究发现，HSV-1感染可诱导细胞内β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集、磷酸化Tau（pTau）增多、分泌Aβ42/40比例降低等AD样分子表型，并发现转录组变化富集于AD相关基因。此高通量、可定量平台为筛选针对神经炎症的AD治疗药物提供了有力工具，可补充三维类器官和动物模型的不足。
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种困扰全球的神经退行性疾病，其典型病理特征包括脑内β-淀粉样蛋白（Amyloid-β, Aβ）斑块沉积和过度磷酸化的Tau蛋白（p-Tau, pTau）形成的神经原纤维缠结。越来越多的证据表明，神经炎症是驱动AD发生与发展的重要推手。其中，病毒等病原体感染，特别是单纯疱疹病毒1型（Herpes Simplex Virus 1, HSV-1），被发现与AD患病风险及病理变化存在关联，提示病原体触发的免疫反应可能参与了AD的发病过程。为了更深入地理解这种关联并开发新的治疗策略，科学家们需要能够模拟人脑复杂微环境的实验模型。传统的小鼠模型在物种间存在差异，而近年来兴起的三维（3D）人脑类器官（cerebral organoids）虽能高度模拟脑结构，但在进行高通量药物筛选时面临通量低、细胞感染/药物处理不均一等挑战。那么，能否建立一个既保留人脑细胞多样性，又适用于大规模、标准化检测的实验平台呢？
针对上述挑战，这项发表于《npj Dementia》的研究报道了一个创新的解决方案。研究人员构建了一个基于二维（2D）培养的人脑类器官解离细胞（dissociated cells from cerebral organoids, dcOrgs）的高通量定量平台，用于模拟和研究AD相关的神经炎症。这个平台巧妙地结合了人脑类器官的细胞复杂性（包含神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞等）和2D细胞培养的通量优势，为研究HSV-1感染如何诱发AD样病理变化，以及测试潜在治疗药物（如抗病毒药阿昔洛韦 Acyclovir, ACV）的效果，提供了一个强有力的工具。
本研究主要运用了以下几项关键技术方法：首先，利用人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）分化生成三维大脑类器官，随后将其解离并在二维条件下培养，形成包含多种神经细胞类型（包括自发产生的小胶质细胞）的dcOrgs模型。其次，通过携带绿色荧光蛋白（GFP）标签的重组HSV-1病毒株感染dcOrgs，建立神经炎症模型。再者，结合流式细胞术（Flow Cytometry），使用多种特异性抗体（如识别Aβ聚集体的阿杜卡单抗Aducanumab、识别Aβ单体的索拉珠单抗Solanezumab，以及识别不同磷酸化位点的Tau抗体等），在单细胞水平上定量检测细胞内Aβ、pTau等AD相关蛋白的丰度及其与病毒蛋白的共定位。此外，研究还通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞培养上清液中分泌的Aβ亚型（Aβ40, Aβ42, Aβ38）水平。最后，利用批量RNA测序（Bulk RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，全面解析HSV-1感染前后dcOrgs的转录组变化，并通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）探究差异表达基因与AD等疾病相关基因的关联。
研究结果
HSV-1感染在二维大脑类器官解离细胞中成功建立
研究人员成功从hiPSCs分化出包含神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞（约7.1%的细胞表达小胶质细胞标记物P2RY12）的dcOrgs。用HSV-1-GFP病毒感染后，超过50%的细胞在23小时后显示GFP阳性，表明感染成功。而用抗病毒药物ACV处理或紫外线灭活（UV-inactivated）的病毒作为对照，则几乎看不到感染迹象。RNA测序数据显示，不同处理的dcOrgs样本间具有高度可重复性，且HSV-1感染引发了显著的转录组扰动。
细胞内Aβ聚集物与HSV-1高度共现，且主要由细胞自主效应驱动
通过多色流式细胞术分析发现，在HSV-1感染的dcOrgs中，识别Aβ聚集体的抗体（阿杜卡单抗）信号与病毒蛋白（GFP）信号呈强正相关，其相关性高于识别Aβ单体的抗体（索拉珠单抗）。这种强共定位主要出现在死亡细胞中。进一步分析同一感染样品内GFP阳性（HSV-1+）和GFP阴性（HSV-1-）的活细胞发现，HSV-1+细胞内的Aβ（无论聚集态还是单体）信号均显著高于HSV-1-细胞，表明Aβ的增多主要是由细胞自主（cell intrinsic）因素，即病毒在细胞内的活动所驱动，而非旁观者效应。作为对照，用甲型流感病毒（IAV）感染dcOrgs也观察到了Aβ与病毒的共定位，但其相关性模式与HSV-1不同（在活细胞中相关性更强），提示不同病毒可能通过不同机制影响Aβ代谢。
HSV-1感染导致Tau磷酸化增加并改变分泌性Aβ谱
流式分析还显示，HSV-1蛋白丰度与总Tau蛋白及在多个AD相关位点磷酸化的Tau（如pTau-181, pTau-217）丰度高度相关。对细胞培养上清液的检测发现，与模拟感染（Mock）的dcOrgs相比，HSV-1感染组的dcOrgs分泌的Aβ42、Aβ40和Aβ38总量均显著下降，但Aβ42/Aβ40的比值也显著降低。这表明感染可能改变了Aβ的产生或分泌过程，导致毒性更强的Aβ42相对比例减少（可能更多滞留于细胞内聚集）。而IAV感染虽然也降低了总Aβ分泌量，但并未改变Aβ42/Aβ40的比值。用ACV处理HSV-1感染的dcOrgs，可以部分挽救异常的Aβ分泌谱。
HSV-1感染改变dcOrgs细胞组成，模拟AD中的胶质增生和神经元丢失
通过流式细胞术检测15种细胞类型特异性标记物，研究人员评估了HSV-1感染对dcOrgs细胞群体比例的影响。结果显示，感染导致表达神经元标记物（如NeuN）的神经元比例下降，而表达胶质细胞标记物（如星形胶质细胞的GFAP、小胶质细胞的Iba1）的细胞比例上升。这种神经元丢失和胶质细胞（特别是反应性星形胶质细胞和小胶质细胞）增生的模式，与AD患者脑组织中所见的病理变化相似。ACV处理可以缓解这种细胞比例的变化。
转录组分析揭示HSV-1感染扰动AD相关基因网络
对批量RNA-seq数据进行差异表达基因分析和基因集富集分析发现，在HSV-1感染的dcOrgs中，与AD相关的全基因组关联研究（Genome-Wide Association Study, GWAS）基因被显著富集。这一富集在UV灭活病毒对照或IAV感染组中并未出现，在hiPSCs感染组中也未出现，提示该转录特征需要成熟的神经细胞环境（特别是胶质细胞）才能充分展现。此外，感染还显著激活了cGAS/STING、干扰素（IFN）应答、JAK/STAT等多个天然免疫信号通路。
单细胞转录组解析感染细胞的异质性及ACV的转录组挽救效应
通过scRNA-seq，研究人员将细胞分为“真实未感染”（来自Mock组）、“流产感染”（来自感染组但病毒转录本少）和“真实感染”（来自感染组且病毒转录本多）三类。分析显示，差异表达基因在“真实感染”与“真实未感染”细胞的比较中，对AD相关基因的富集最为显著。进一步分析ACV的治疗效果，研究人员将感染后因ACV处理而表达水平恢复至接近未感染状态的基因定义为“被挽救”（Rescued）基因，而将那些在ACV处理后表达变化反而加剧或出现新变化的基因定义为“加剧”（Exacerbated）基因。在两次独立实验中，均鉴定出了一批稳定被ACV挽救的基因，它们与神经发生、细胞粘附和线粒体功能等通路相关。
研究结论与意义
本研究成功建立并验证了一个基于人源二维大脑类器官解离细胞（dcOrgs）的高通量、定量化研究平台，用于模拟由HSV-1感染触发的AD相关神经炎症。该平台能够复现AD关键的分子病理特征，包括细胞内Aβ（特别是聚集形式）与病毒的共定位增加、多种pTau形式的累积、分泌性Aβ42/Aβ40比值降低、以及反应性胶质增生和神经元丢失的细胞比例变化。更重要的是，转录组学分析证实，HSV-1感染特异性地扰动了与AD遗传风险相关的基因网络，这为“感染假说”提供了来自人源细胞模型的直接分子证据。
该研究的核心意义在于其方法论上的创新和应用前景。首先，2D dcOrgs模型兼顾了人脑细胞的多样性和异质性，以及二维培养体系的高通量、标准化操作优势，使其非常适用于大规模的药物筛选和机理研究。其次，研究不仅验证了HSV-1感染可诱导AD样表型，还详细描绘了其背后的分子和细胞图谱，为理解病毒参与AD发病的机制提供了丰富线索。例如，细胞内Aβ聚集与病毒的高度共现及其细胞自主性，支持了Aβ可能作为先天性免疫应答一部分以对抗病原体，但过度反应最终导致病理沉积的假说。最后，研究证实抗病毒药物ACV能够在不同程度上逆转HSV-1感染引起的多种病理表型和转录组扰动，这为将阿昔洛韦或其前药伐昔洛韦（Valacyclovir, VCV）用于AD治疗（目前已有相关临床试验）提供了临床前实验依据，并揭示了其潜在的分子作用靶点。
总之，这项研究开发了一个强大且灵活的平台，它将有助于加速针对神经炎症的AD新药研发，深化对感染与神经退行性疾病关联的理解，并可能最终助力于开发出更有效的AD预防和治疗策略。
