APPE590D突变双重增强Aβ与Aη生成并加剧tau病理：为阿尔茨海默病致病机制提供新见解

《npj Dementia》：APP E590D mutation increases generation of Aβ and Aη peptides and exacerbates tauopathy

本研究针对APP基因中致病性未明的E590D（E665D）突变，通过细胞与动物模型深入探究了其对淀粉样前体蛋白（APP）加工及tau病理的影响。研究发现，该突变不仅通过促进APP内吞和β-分泌酶（BACE1）切割增加Aβ生成，还同时增强了η-切割途径，导致突触毒性肽段Aη水平升高。更重要的是，APPE590D表达促进了tau蛋白的播种和聚集，并在tauP301S小鼠模型中加剧了磷酸化tau（phospho-tau）病理与神经炎症。该研究首次揭示了APPE590D突变通过双重途径（Aβ与Aη）驱动阿尔茨海默病（AD）病理的独特模式，为理解APP相关致病机制及开发新治疗策略提供了重要依据。

阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）是导致痴呆的最常见原因，其大脑中的两大标志性病理特征——由淀粉样蛋白-β（Aβ）组成的老年斑和由过度磷酸化的tau蛋白构成的神经原纤维缠结——长期以来被视为疾病发展的核心驱动力。淀粉样前体蛋白（Amyloid Precursor Protein, APP）是Aβ的前体蛋白，其基因突变是导致家族性早发型AD的重要原因。这些突变通常通过改变APP的切割加工，增加具有神经毒性的Aβ的产生或聚集，从而为经典的“淀粉样蛋白级联假说”提供了关键支持。然而，在众多已发现的APP突变中，有超过50个突变的致病性尚不明确，这为精准理解AD的遗传病因和疾病机制带来了挑战。其中，APP^E590D（在APP₇₇₀亚型中为E665D）突变就是一个典型案例。尽管该突变早在1994年和2021年分别于两名经病理或临床证实的AD患者中发现，但由于其极为罕见，其确切的致病性一直存在争议。之前的体外研究甚至提示其可能为良性突变。这种不确定性阻碍了我们对AD完整致病图谱的认识。为了解开这个谜团，一项最新研究对APP^E590D突变展开了全面而深入的探究。

这项研究发表在《npj Dementia》期刊上，旨在系统评估APP^E590D突变对多种APP代谢产物的影响，并明确其在细胞和动物模型中对tau病理的作用，从而判定其致病潜力。

为了开展研究，作者们运用了多种关键技术方法。在细胞模型方面，他们通过定点诱构建了APP₆₉₅^E590D突变体质粒，并分别在HEK293T细胞、稳定表达4R tau的HeLa细胞、以及用于检测tau播种活性的Tau-RD-P301S-CFP/YFP FRET生物传感器细胞中进行转染。同时，研究还使用了重组腺相关病毒9型（rAAV9）在离体培养的小鼠原代神经元中表达突变体APP。在动物模型方面，研究将高滴度的rAAV9-APP₆₉₅^WT或rAAV9-APP₆₉₅^E590D通过立体定位注射的方式导入5月龄的tau^P301S（PS19）转基因小鼠的海马区，并于3个月后进行分析。检测手段涵盖了蛋白质免疫印迹（Western Blot）分析APP全长及其多种切割片段（如Aβ、Aη、sAPPβ、CTFβ、CTFη）、细胞表面生物素化与内吞实验、免疫细胞化学与免疫组织化学、以及滤膜捕获（Filter-Trap）实验来检测不溶性tau聚集体。

研究结果部分清晰地展示了该突变的多重致病效应：

APP^E590D增加Aβ和Aη的生成

在转染了APP₆₉₅^E590D的HEK293T细胞中，研究人员发现，与野生型（WT）相比，突变体使分泌到培养基中的Aβ水平增加了约2.4倍，同时分泌型APPβ（sAPPβ）和胞内的C末端片段-β（CTFβ）也显著增加，这表明该突变促进了β-分泌酶（BACE1）对APP的切割。更具创新性的发现是，APP₆₉₅^E590D还显著增加了另一种APP衍生肽段——Aη的生成，其水平提升了约4倍。Aη是一种约15 kDa的肽段，由η-分泌酶在β-切割位点上游约93个氨基酸处切割APP产生，此前已被证明具有突触毒性，可损害海马长时程增强（LTP）。此外，作为η-切割的中间产物，APP-CTFη的水平也明显升高。在更接近生理状态的小鼠原代神经元中，通过rAAV9导入APP₆₉₅^E590D同样验证了其对Aβ、sAPPβ和Aη生成的促进作用。

APP^E590D减少细胞表面APP并增强APP内吞

由于β-和γ-分泌酶对APP的加工依赖于APP从细胞膜的内吞，研究者进一步探究了该突变对APP转运的影响。通过免疫细胞化学和细胞表面生物素化实验，他们发现APP₆₉₅^E590D在细胞表面的水平显著低于野生型。随后的内吞实验表明，被抗体或生物素标记的APP₆₉₅^E590D能更快地被内吞并定位到早期内体（与EEA1标记共定位增加），这为观察到的Aβ生成增加提供了机制解释：更快的内部化为β-分泌酶加工创造了条件。

APP^E590D增加tau播种和聚集

Aβ与tau病理之间存在密切关联。为了探究APP^E590D是否影响tau蛋白，研究者在Tau-RD FRET生物传感器细胞中进行了tau播种实验。这些细胞在摄入病理性tau“种子”后，会触发其内部表达的tau重复结构域发生聚集，产生荧光斑点。结果显示，在给予外源性tau种子的条件下，表达APP₆₉₅^E590D的细胞中出现的tau聚集荧光斑点显著多于表达野生型APP或空载对照的细胞。在稳定表达4R tau的HeLa细胞中，过表达APP₆₉₅^E590D导致可溶性tau水平降低，而通过滤膜捕获实验检测到的RIPA不溶性tau聚集体却显著增加。这些结果共同表明，APP₆₉₅^E590D能够增强tau的播种能力和聚集过程。

APP₆₉₅^E590D在tau^P301S小鼠中加剧tau病理和神经炎症

为了在更完整的生物体系中验证上述发现，研究团队在tau^P301S转基因小鼠的海马区立体定位注射了表达APP₆₉₅^WT或APP₆₉₅^E590D的rAAV9病毒。三个月后，脑组织分析显示，与注射对照病毒或APP₆₉₅^WT的小鼠相比，注射APP₆₉₅^E590D的小鼠其海马组织中可溶性与不可溶性磷酸化tau（pS199/202）的水平均显著升高。免疫组织化学染色进一步在皮层和海马区观察到了更广泛的磷酸化tau病理。值得注意的是，在体内虽未检测到典型的Aβ单体，但出现了一个约17 kDa的APP衍生片段，且仅存在于APP₆₉₅^E590D组，提示体内APP加工同样发生了改变。与加剧的tau病理相伴随的是，突变体表达还引发了更显著的星形胶质细胞增生（GFAP标记增加）和小胶质细胞增生（IBA1标记增加），即神经炎症反应的增强。

在讨论与结论部分，本研究首次全面阐明了APP^E590D突变的致病性。与大多数靠近β或γ切割位点的经典AD致病突变不同，E590D突变位于η-切割产生的Aη肽段序列内，距离β-切割位点有6个氨基酸。该研究最重要的发现是，APP^E590D是迄今为止已知的唯一能同时增加Aβ和Aη两种不同APP衍生肽段生成的突变。这提示其可能通过一种独特的双重模式驱动AD病理：一方面通过加速APP内吞促进经典的Aβ生成通路；另一方面则增强η-切割，产生已知能损害突触可塑性的Aη肽段。研究进一步证明，这种突变的表达能够促进tau蛋白的播种和聚集，并在tau病变小鼠模型中显着加剧tau病理和神经炎症。这为之前携带此突变AD患者出现的早期认知功能障碍提供了可能的分子解释。研究者推测，Aη、Aβ以及APP^E590D胞外域产物的联合作用，共同推动了tau病理的发展。突变可能通过改变附近氨基酸（如Thr588和Ser592）的O-糖基化修饰，从而影响APP对BACE1和/或η-分泌酶的可及性，这为未来的机制研究指明了方向。

总之，这项研究以充分的实验证据确立了APP^E590D突变的致病性，揭示了其通过同时增强Aβ和Aη生成、并加速tau病变的独特致病机制。这不仅解决了一个长期悬而未决的遗传学问题，加深了对APP复杂加工途径及其在AD中作用的理解，也为针对Aη等非Aβ通路的新型治疗策略开发提供了重要的理论依据。