《Frontiers in Immunology》：Glatiramer acetate stimulates phagocytosis and intracellular killing of Escherichia coli by macrophages and microglial cells
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醋酸格拉替雷（GA）作为一种用于治疗多发性硬化（MS）的合成多肽，临床使用中并未增加感染风险。本研究发现，GA能够以浓度和时间依赖性方式，显著增强野生型小鼠腹腔巨噬细胞和小胶质细胞对包裹型大肠杆菌（E. coli）K1的吞噬（phagocytosis）及胞内杀灭（intracellular killing）能力。其作用部分依赖于白细胞介素-10（IL-10）信号通路，且在老龄小鼠的巨噬细胞中同样有效。研究表明，GA是一种能够提升固有免疫防御、且不引发强烈促炎反应的免疫调节剂，为应对多重耐药细菌威胁提供了新思路。
醋酸格拉替雷：一种增强固有免疫防御的免疫调节剂
摘要
背景：与其他用于治疗多发性硬化（MS）的药物不同，合成多肽醋酸格拉替雷（GA）并未与感染风险增加相关。我们研究了GA对固有免疫细胞的影响及其摄取和杀灭细菌的能力。
方法：将GA与来自野生型C57BL/6和白细胞介素（IL）-10-/-小鼠的腹腔巨噬细胞和小胶质细胞共孵育。随后，分析这些吞噬细胞对包裹型大肠杆菌（E. coli）K1的吞噬和胞内杀灭作用。使用野生型小鼠的小胶质细胞，通过添加抗体阻断IL-10。对野生型和IL-10-/-小鼠进行GA体内给药，之后分离腹腔巨噬细胞并检测其吞噬能力。
结果：GA以浓度和时间依赖性方式，增强了从野生型小鼠分离的巨噬细胞和小胶质细胞对E. coli的吞噬作用。GA也增强了E. coli的胞内杀灭。来自IL-10-/-小鼠的巨噬细胞对GA的敏感性低一个数量级。阻断IL-10以浓度依赖性方式降低了小胶质细胞的吞噬作用。GA也能刺激老龄小鼠巨噬细胞的吞噬作用。GA的体内给药增加了野生型而非IL-10-/-巨噬细胞的体外吞噬能力。
结论：由于多重耐药细菌的威胁日益增加，副作用少、能够刺激细菌吞噬和杀灭的免疫调节剂备受青睐。GA可刺激致病菌的吞噬和胞内杀灭。由于其即使在长期治疗中也具有低毒性，GA是提高患者抗感染能力、可能减少抗生素用量的优秀候选药物。
引言
多发性硬化（MS）患者因其残疾和疾病修正治疗药物的使用，相较于普通人群感染（细菌、病毒、真菌或寄生虫）风险增加。许多用于治疗MS急性发作或减少复发及残疾进展的药物会损害免疫监视，可能增加患者发生社区获得性或机会性感染（包括中枢神经系统感染）的风险。特别值得关注的是由JC病毒引起的进行性多灶性白质脑病（PML）。醋酸格拉替雷（GA）是一种丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸的混合随机聚合物，传统上被认为直接作用于T淋巴细胞，诱导其向辅助性T细胞2（Th2）转化。更近期的研究表明GA对抗原呈递细胞（特别是单核细胞和树突状细胞）有影响，即GA具有影响固有和适应性免疫系统的广泛免疫调节特性。使用GA尚未与感染风险增加相关。GA似乎不是免疫抑制剂。然而，GA对吞噬细胞摄取和杀灭活病原体的影响尚未被研究。本研究旨在评估GA对吞噬细胞摄取和杀灭细菌能力的影响。
材料与方法
本研究使用了GA（Copaxone?）、抗IL-10抗体、大肠杆菌（Escherichia coli）血清型O18:K1:H7菌株、雌性年轻成年和老年C57BL/6小鼠、IL-10缺陷型小鼠等材料。通过腹腔灌洗制备原代巨噬细胞培养物，从新生C57BL/6小鼠大脑制备原代小胶质细胞培养物。通过定量吞噬和胞内杀灭实验（抗生素保护实验），评估GA处理对吞噬细胞功能的影响。具体为，吞噬细胞经不同浓度GA（1-300 μg/mL）刺激不同时间（1-120小时）后，与E. coliK1共孵育60分钟，洗涤后添加庆大霉素杀灭胞外细菌，裂解细胞并定量铺板计数菌落形成单位（CFU），以评估吞噬（60分钟庆大霉素处理后胞内细菌数）和杀灭（庆大霉素处理60、120、180分钟后胞内细菌数的减少）效率。部分小鼠在体内接受GA皮下注射（每日150 μg/只，连续5天），之后分离其巨噬细胞进行体外吞噬功能检测。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞培养上清中细胞因子浓度。使用GraphPad Prism软件进行统计学分析，非正态分布数据采用Kruskal-Wallis检验，继以Dunn多重比较检验。
结果
GA以剂量依赖性方式刺激腹膜巨噬细胞和小胶质细胞对E. coli的吞噬，且不降低培养上清中的细菌密度，表明GA无直接抗菌活性。在巨噬细胞中，30 μg/mL GA效果最佳，而在小胶质细胞中，100 μg/mL才能产生最大效应。在腹膜巨噬细胞中，30 μg/mL GA与0.01 μg/mL脂多糖（LPS）效果相当，二者均使吞噬中位数增加约500%。在小胶质细胞中，100和300 μg/mL GA使吞噬中位数增加约600%，而LPS使吞噬增加约1200%。在腹膜巨噬细胞中，GA刺激引起的吞噬增加呈时间依赖性，刺激24小时效果最佳。
GA在最有效浓度下（巨噬细胞30 μg/mL，小胶质细胞100 μg/mL）不仅刺激了E. coli的摄取，也刺激了其胞内杀灭。来自IL-10缺陷型小鼠的腹膜巨噬细胞，需要比野生型巨噬细胞高一个数量级的GA浓度（300 μg/mL）才能刺激细菌吞噬。在小胶质细胞中，抗IL-10抗体以浓度依赖性方式抑制GA对E. coli吞噬的刺激作用，可导致约50%的中位抑制。
体内用GA预处理野生型小鼠（连续5天）可使其巨噬细胞的E. coli吞噬中位数增加约70%。而在IL-10缺陷型小鼠中，体内GA预处理并未增加体外细菌吞噬。
与0.01 μg/mL LPS不同，30 μg/mL GA与腹膜巨噬细胞孵育24小时并未刺激肿瘤坏死因子-α（TNFα）和白细胞介素-12/23 p40（IL-12/23 p40）的释放。GA和LPS均未大量释放IL-12 p70和γ-干扰素。
GA不仅能增加年轻成年小鼠对E. coli的吞噬，也能刺激来自20月龄老年小鼠的腹膜巨噬细胞对E. coli的吞噬，中位数增加609%。相比之下，LPS对老年小鼠吞噬细胞的刺激作用较弱，与对照的差异无统计学意义。
讨论
败血症和脑膜炎是危及生命的疾病。大肠杆菌（E. coli）是其中最常见和毒力最强的病原体之一。先前有报道称GA在体外可增加对荧光微珠的吞噬。本研究证实，预刺激巨噬细胞和小胶质细胞可增强其摄取和杀灭致病性包裹型E. coli的能力，这对于评估GA的免疫调节特性和患者安全性至关重要。
与年龄相关的免疫功能衰退（免疫衰老）包括细胞介导和体液免疫反应下降。老年人以促炎细胞因子/趋化因子基础水平升高，以及在感染或接种疫苗时无法产生适当免疫反应为特征。本研究发现，低浓度GA不仅能增加年轻小鼠巨噬细胞对致病性E. coli的吞噬，对老年小鼠巨噬细胞同样有效，这使得GA成为老年人感染预防的有前景的候选药物。
GA与棕榈酰乙醇酰胺（PEA）类似，可增强巨噬细胞和小胶质细胞摄取和杀灭E. coli的能力，但不会刺激促炎细胞因子TNFα、IL-12/23 p40、IL-12 p70和γ-干扰素的释放。由于促炎性细菌产物会损伤轴突和神经元胞体，在败血症和脑膜炎期间，通过吞噬细胞在抗生素治疗前或同时减少血流和脑脊液中的细菌负荷，可能有助于减轻神经元损伤和E. coli败血症及脑膜炎的后遗症。
在原代大鼠小胶质细胞中，GA可增加IL-10分泌，同时降低TNFα释放，但不影响一氧化氮（NO）释放。添加抗IL-10受体抗体（与本研究中使用的抗IL-10抗体类似）可降低吞噬作用。在人类全血体外实验中，IL-10强烈增加单核细胞CD14依赖性吞噬E. coli以及CD14依赖性和非依赖性吞噬凋亡细胞的能力。IL-10上调单核细胞CD14的表达。这些发现阐释了GA可能通过IL-10发挥作用的机制。在防御感染方面，GA不仅具有抗炎特性，在适当条件下还能刺激对碎片乃至病原体的吞噬。需要进一步研究其涉及的信号通路和受体。
结论
由于多重耐药细菌对患者的威胁日益增加，副作用少、毒性低、能够刺激吞噬并随后杀灭致病菌的药物备受青睐。由于GA即使在长期治疗中也具有低毒性，且能刺激年轻和老年小鼠的细菌吞噬，它是提高年轻和老年人抗感染能力、从而预防感染并减少抗生素用量的优秀候选药物。在免疫缺陷患者（如老年患者、重症监护患者或接受免疫抑制剂治疗的患者）中启动临床试验之前，我们的体外观察结果应在适当的动物模型中进行验证。
