《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Generation of a human vascularized 3D airway model replicating native mucosal heterogeneity
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本期推荐这篇前沿的综述性论文，它系统性地阐述了一种能够重现人体气道黏膜天然复杂性的三维（3D）、血管化体外模型构建方法。该模型通过明胶水凝胶支架共培养人原代气道上皮细胞、内皮细胞和基质细胞，经过气-液界面（ALI）分化成熟后可形成典型的假复层上皮结构，包含功能性纤毛、分泌细胞和血管样网络。该模型克服了传统二维（2D）模型和单一细胞培养的局限性，为呼吸道疾病机制研究、药物筛选及感染模型（如SARS-CoV-2）提供了更接近生理环境的强大平台。
构建具有血管化三维结构的仿生人源气道黏膜模型：迈向重现生理异质性的标准化方法
摘要
传统的气道体外模型多采用二维培养条件，难以复现生理性的三维（3D）环境，且无法模拟黏膜中多种细胞类型间的直接相互作用。本文提供了一份详细、可重复的复杂三细胞共培养模型构建指南，该模型可用于研究健康和疾病状态下的人体气道环境。其核心在于制备一种上皮化的纤维蛋白水凝胶，其中预先包埋内皮细胞和基质细胞。为确保其完全分化为具有粘膜纤毛功能的表型，样本需在气液界面（ALI）条件下维持培养28天。成熟后，可采用免疫组化/细胞化学、电子显微镜、纤毛摆动频率分析、粘膜纤毛清除功能测量及RNA提取等技术验证其形态与功能。经过4周分化，模型可形成包含基底细胞、多纤毛细胞和分泌细胞在内的分化良好的假复层上皮，并表现出生理性的纤毛摆动频率、粘液生成及功能性颗粒清除能力。在水凝胶内部，内皮细胞可形成三维血管样结构网络。这些特性使本模型在模拟人类黏膜异质性方面极具优势，尤其相较于使用肿瘤来源或永生化细胞系、单一培养或刚性基底的传统气道模型。因此，本方案为同行研究者提供了一条实现稳健气道体外建模的途径，且该过程可在标准细胞培养实验室完成，无需特殊设备或专业知识。
1 引言
气道上皮是呼吸系统的第一道防线，由至少10种不同的细胞类型构成，其中以基底细胞、多纤毛细胞和分泌细胞最为丰富。上皮由其固有层支持，后者是一个具有神经支配和血管化的疏松结缔组织层。两者共同构成呼吸道黏膜。虽然间质部分提供营养和结构完整性，但上皮细胞通过协调的纤毛摆动清除粘液包裹的病原体和颗粒，确保气道通畅。间质和气道上皮细胞相互作用，对气道稳态和再生不可或缺。
哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺癌等高发疾病均起源于气道并在其中发生。传统的气道疾病模型几乎完全依赖于动物实验，但越来越多的证据表明其结果在预测临床疗效和安全性方面存在局限。相比之下，人源性气道体外模型作为一种有前景的替代方案，可提高药物或感染研究的准确性。然而，简单的单层上皮细胞培养模型因无法体现黏膜内细胞相互作用的生理复杂性而受到批评。因此，对分化良好、三维工程化的体外组织的需求日益增长。
本工作整合了呼吸上皮和血管结构组织工程方面的多年经验，开发出一种基于水凝胶支架的复杂多细胞类型体外气道模型。该成熟组织包含分化良好的、具有粘膜纤毛表型的假复层上皮，以及其下方纤维蛋白水凝胶中形成的血管样萌芽结构。
该三细胞共培养模型用途广泛，可用于建立疾病模型和药物筛选平台。本团队已证明该模型支持SARS-CoV-2病毒复制，并观察到其对灭活病毒颗粒的纤毛增多反应。此方法可扩展用于研究哮喘、慢性阻塞性肺疾病等其他常见气道疾病。该模型允许整合其他细胞类型，如免疫细胞或气道平滑肌细胞。此外，可用来自疾病供者的细胞或基因工程诱导多能干细胞衍生的细胞替代健康细胞，以研究囊性纤维化或原发性纤毛运动障碍等先天性疾病。三维水凝胶系统还支持整合化学和机械性能可调的基质，以模拟肺部疾病进展过程中的组织重塑。除临床前体外应用外，该三细胞共培养也是基础研究问题的有力工具。作为一个高度可控的系统，其易于调整以隔离特定参数。该模型在经典的器官置换组织工程领域也颇具价值，未来有望为需要气管或支气管移植的患者提供基于此黏膜模型的完整气道植入物解决方案。
2 材料与设备
2.1 试剂
详细列出了构建模型所需的所有化学试剂，包括2-丙醇、醋酸、琼脂糖、气道上皮细胞生长培养基、两性霉素B、牛血清白蛋白、氯化钙、氯仿、环丙沙星、DAPI、Dulbecco改良Eagle培养基、Dulbecco磷酸盐缓冲液、无水乙醇、乙二胺四乙酸、内皮细胞生长培养基2、胎牛血清、人血浆纤维蛋白原、荧光微球、明胶、戊二醛、盐酸异丙肾上腺素、角质形成细胞无血清培养基、Mesenpan、MucilAir培养基、青霉素-链霉素、青霉素-链霉素/两性霉素B混合液、氯化钾、叠氮化钠、氯化钠、碳酸氢钠、Sorensen磷酸盐缓冲液、牛血浆凝血酶、氨甲环酸、TRI试剂溶液、Tris碱、Tris盐酸、台盼蓝、超纯水。
2.2 耗材
详细列出了细胞培养和实验过程所需的消耗品，如铝箔、细胞培养瓶、细胞培养插入物、腔室载玻片、深孔板、透析膜、透析管夹、包埋盒、包埋模具、低蛋白结合管、手术刀、螺帽管、封口膜、包埋盒海绵、无菌滤器、注射器等。
2.3 设备
详细列出了所需的各种仪器设备，包括铝制冷却盘、分析天平、高压灭菌器、硼硅酸盐瓶、明场倒置显微镜、细胞计数装置、脱水设备、荧光倒置/正置显微镜、高速相机、磁力搅拌加热板、磁力搅拌子、切片机、液氮罐、石蜡包埋站、pH计、移液控制器、分光光度计、水纯化系统等。
2.4 配方
详细提供了20种关键溶液的配制方法、储存条件和注意事项，包括2%碳酸氢钠+1 mM EDTA溶液、0.1%叠氮化钠溶液、Tris缓冲盐水、气道上皮细胞生长培养基、角质形成细胞无血清培养基、内皮细胞生长培养基2、明胶包被溶液、完全DMEM、Mesenpan培养基、25 mM CaCl2溶液、凝血酶溶液、纤维蛋白原储备溶液、增殖培养基、分化培养基、荧光微珠悬浮液、Carnoy固定液、2%琼脂糖溶液、3%封闭液。
3 方法
3.1 人原代气道上皮细胞培养
人原代气道上皮细胞可分离自鼻甲、气管或支气管组织。细胞在气道上皮细胞生长培养基中扩增，并在第0代冻存。最终的三细胞共培养使用第1代气道上皮细胞制备。所有实验至少使用三个生物学重复。
3.2 人原代内皮细胞培养
人原代内皮细胞来源于人脐带静脉。细胞在内皮细胞生长培养基2中培养。最终三细胞共培养仅使用第4代或更低代次的内皮细胞。所有实验至少使用三个生物学重复。具体步骤包括用明胶包被细胞培养瓶、解冻内皮细胞、以及内皮细胞的扩增。
3.3 人原代基质细胞培养
人原代基质细胞可分离自气管、支气管组织或骨髓。气管和骨髓来源的基质细胞均在液氮中冻存。最终三细胞共培养仅使用第6代或更低代次的细胞。所有实验至少使用三个生物学重复。具体步骤包括解冻基质细胞和基质细胞的扩增。
3.4 细胞负载水凝胶的制备
基质细胞和内皮细胞扩增并收集后，利用其细胞悬液、TBS、氯化钙、凝血酶和纤维蛋白原制备组分A和组分B。所有成分在混合前置于冰上。两种组分在细胞培养插入物内混合，以产生最终纤维蛋白原浓度为5 mg/mL的柔软粘弹性凝胶。混合后，在37°C下孵育40分钟，使凝胶完全聚合，随后将呼吸道上皮细胞接种到纤维蛋白凝胶的管腔面。
3.4.1 水凝胶组分的制备
在冰上解冻纤维蛋白原和凝血酶等分试样。用TBS将纤维蛋白原储备溶液稀释至10 mg/mL。制备组分B时，首先将凝血酶和CaCl2混合，并置于冰上备用。
3.4.2 细胞悬液的制备
分别消化、计数并重悬基质细胞和内皮细胞，在增殖培养基中调整至初始浓度21.81 x 106cells/mL。
3.4.3 水凝胶制备
将两种细胞悬液各27.5 μL加入凝血酶/CaCl2混合物中。在置于铝制冷却盘上的标准12孔板插入物中，先加入100 μL组分A溶液，然后快速加入100 μL组分B溶液，上下吹打三次混匀。在37°C孵育40分钟使凝胶完全聚合。之后将插入物转移至深孔板，在膜基底侧加入4 mL增殖培养基。
3.4.4 呼吸道上皮细胞接种
解冻第0代原代气道上皮细胞，离心后重悬于增殖培养基中，计数并稀释至1.8 x 105cells/mL。将0.5 mL细胞悬液转移到水凝胶顶部，实现约8 x 104cells/cm2的接种密度。在孔板空孔中加入无菌水以减少培养基蒸发。
3.5 三细胞共培养的成熟
培养第一周，样本维持在浸没状态以实现上皮融合。之后，通过切换到分化培养基并允许上皮细胞直接接触加湿空气来启动分化。样本分化成熟28天。使用深孔板以减少换液频率。培养基始终添加抗纤溶的氨甲环酸以防止纤维蛋白凝胶在几天内被消化，并添加抗生素/抗真菌剂以避免污染。
3.5.1 增殖期维持
每48-72小时更换一次培养基，即周一、周三、周五。更换时检查污染情况，在膜顶侧加入0.5 mL新鲜增殖培养基，在孔内基底侧加入4 mL。
3.5.2 分化期维持
培养7天后，移除增殖培养基，仅在孔内基底侧加入4 mL分化培养基，而顶侧保持空置。之后每48-72小时更换一次培养基，即周一、周三、周五。仅更换基底侧的分化培养基。
3.6 三细胞共培养的终止与下游分析
终止程序高度依赖于所需的下游检测。每个插入物可进行多种评估方法。注意，粘膜纤毛清除功能表征需要完整的细胞培养插入物，之后可对样本进行策略性分割。
3.6.1 粘膜纤毛清除功能表征
在成熟三细胞共培养的管腔面，记录粘液包裹的荧光微球在纤毛摆动驱动下的运输情况。添加微球后，在室温下录制视频。使用Fiji插件Trackmate确定粒子轨迹和相应的轨迹平均速度。
3.6.2 从细胞培养插入物中移除水凝胶
用镊子将插入物从孔板中取出。用尖头手术刀沿膜边缘缓慢切割，将膜从插入物上取下。将膜及附着的水凝胶置于玻璃培养皿中。用圆头手术刀将水凝胶分割成不同大小的块，其大小取决于下游应用。
3.6.3 纤毛摆动频率分析
使用配备高速相机和温度孵育单元的倒置明场显微镜观察实时纤毛摆动。在32°C下，使用60倍物镜记录多个视野。使用Fiji插件FreQ分析摆动频率。这种基于快速傅里叶变换的方法可确定二维图像中的像素强度振荡，并将结果总结在纤毛摆动频率的热图和直方图中。
3.6.4 组织学
使用Carnoy固定液固定后，通过脱水系列处理样本。然后进行琼脂糖包埋、石蜡包埋。使用标准组织学方案切割和染色3 μm石蜡切片，进行过碘酸希夫反应和/或免疫组化。验证过的抗体包括血管紧张素转换酶2、乙酰化微管蛋白、分泌球蛋白家族1A成员1、血小板内皮细胞粘附分子1、紧密连接蛋白claudin 1、叉头框蛋白J1、角蛋白5、黏蛋白5AC、黏蛋白5B、广谱角蛋白、P21激活激酶1/2/3、肿瘤蛋白p63。
3.6.5 整体免疫荧光染色
为可视化样本内部的三维血管结构，对内皮细胞标志物血小板内皮细胞粘附分子1和间充质丝蛋白波形蛋白进行整体免疫荧光染色。使用具有高Z轴深度和分辨率的荧光显微镜对染色样本成像，例如共聚焦或多光子显微镜。血管结构可在2D中使用Z轴的最大强度投影分析，或在3D中使用IMARIS等分割软件分析。
3.6.6 扫描/透射电子显微镜
使用3%戊二醛固定样本，之后根据扫描/透射电子显微镜的标准方案处理，以确认纤毛的存在。
3.6.7 RNA提取
通过机械裂解和胍盐硫氰酸盐-苯酚-氯仿萃取法提取总RNA，用于基因表达分析。
3.7 时间概述
对整个实验流程的各个步骤所需时间进行了总结，从内皮细胞和基质细胞的扩增，到水凝胶制备、细胞接种、成熟培养，再到各项下游分析，总计需要数周时间。
4 预期结果
4.1 三细胞共培养再现气道黏膜的组织学和功能
经过35天培养，初始状态的上皮、内皮和基质细胞类型的组合成功再现了人呼吸道黏膜的组织学特征。呼吸上皮主要由3种细胞类型构成：分泌细胞、纤毛细胞和基底细胞。分泌性俱乐部细胞在上皮层内大量存在。含有粘液的杯状细胞是气道上皮中较稀有的细胞类型。基底细胞通过其标志物TP63和KRT5的阳性表达被检测到。纤毛细胞构成该层的重要部分。高倍扫描和透射电子显微镜图像揭示了三细胞共培养的纤毛表面区域和单个纤毛的详细结构解剖。透射电镜横截面显示了运动纤毛典型的微管排列，即被九个双联体包围的中央微管对。此外，培养28天后，内皮细胞形成了血管样结构。这个互连的网络由周围的基质细胞支持，其分泌促血管生成因子并引导血管形成。
除了纤毛解剖结构，纤毛功能是可用三细胞共培养评估的第二个重要参数。纤毛摆动频率通过实时纤毛摆动的高速记录测定。三细胞共培养上皮的平均纤毛摆动频率预计在6-8 Hz范围内，这与在健康离体多纤毛细胞和其他气道体外模型中报告的结果一致。此外，三细胞共培养表现出功能性的粘膜纤毛清除活性。记录和追踪粘液包裹的荧光微球的运动，其平均轨迹速度中位数约为115.9 μm/s，符合健康人气道的清除速率范围。
4.2 局限性与故障排除
本模型成功使用了鼻、气管和支气管来源的人原代气道上皮细胞。尽管原代细胞与呼吸系统细胞系相比表现出更优越的分化能力，但其可用性有限，并且分化为粘膜纤毛表型高度依赖于多种因素。原代细胞的另一个常见缺点是供体间的差异。目前尚无除在气液界面下进行耗时的成熟培养外的既定工作流程来识别非分化上皮细胞系。有趣的是，在基质支持细胞存在的情况下，上皮细胞分化更稳健，降低了供体失败的几率。本研究使用骨髓和气管来源的基质支持细胞获得了最佳结果。然而，来自鼻甲或脂肪组织的基质细胞在促进上皮分化或血管样结构形成方面效果较差。同样，基质细胞群体的来源和细胞特性都高度影响血管化。本研究使用人脐静脉内皮细胞，特别是在早期代次并与适当类型的支持细胞结合时，实现了稳健的体外血管化。
所描述的程序不受对高度专业化培训、设备或设施的要求所限制。然而，处理和维持高度敏感细胞类型的先进技能是有利的。此外，长时间的培养期大大增加了污染风险。本方案没有加速粘膜纤毛分化过程，而是采用了在气液界面下维持培养4周的黄金标准。尽管如此，陷阱是可以避免的。详细的故障排除指南可参见原文表格5。
