《Cytometry Part A》：GeoMx and RNAscope: A Comparative Assessment of Their Utility for Spatial mRNA Expression Profiling in Formalin-Fixed Breast Cancer Tissue
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本文综述系统地比较了NanoString GeoMx数字空间分析仪与RNAscope原位杂交技术在福尔马林固定（FFPE）乳腺癌组织中进行空间mRNA表达谱分析的性能。研究证实两者在GATA3与SOX10等关键生物标志物的表达上具有强相关性（R值分别为0.87和0.77），同时指出RNAscope在灵敏度与单细胞分辨率方面更具优势，而GeoMx则支持更高通量（可达~1,800个基因）的转录组分析。研究结果提示，方法选择应取决于具体研究目标——当需进行大规模基因筛选时，GeoMx（特别是其癌症转录组图谱CTA）更为高效；若关注低丰度表达或单细胞水平定位，RNAscope是更优方案。两种技术均为肿瘤微环境与生物标志物研究提供了有力的空间转录组学工具。
引言
分子病理学的快速发展对在组织样本中精准检测基因表达的技术提出了更高要求。传统的定量PCR与RNA测序等方法虽适用于整体组织分析，但常缺乏空间背景信息，而这对于理解肿瘤微环境等病理相关组织的复杂异质性至关重要。为弥补这一空白，新型空间转录组学技术应运而生，其中NanoString GeoMx数字空间分析仪（DSP）作为代表，能够基于抗体或RNA探针，在用户定义的感兴趣区域（ROI）内以高通量方式检测蛋白或基因表达。其癌症转录组图谱（CTA）覆盖约1,800个基因，每个基因有五个探针。另一方面，RNAscope是一种成熟的mRNA原位杂交（ISH）方法，其利用特殊的Z形探针设计实现高特异性，并能在单细胞水平可视化单个RNA分子，但通常检测通量较低（1-4重）。本研究旨在直接比较这两种技术在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）乳腺癌临床样本中，针对GATA3、SOX10和PD-L1这三个临床相关生物标志物的空间基因表达检测性能，包括相关性、灵敏度与特异性。
材料与方法
研究使用了两张组织芯片，分别包含三阴性乳腺癌（TNBC, n=48）和具有不同ER/HER2状态的导管腺癌（n=45）。样本经福尔马林固定、石蜡包埋，切片厚度为5μm。
对于GeoMx DSP分析，切片按照标准流程进行脱蜡、复水、抗原修复及蛋白酶K消化。随后与GeoMx CTA探针进行过夜杂交，并进行严格的洗脱。通过免疫荧光染色细胞角蛋白和Syto13核染色以界定肿瘤上皮区域。在GeoMx仪器上，在每个组织芯中手动放置直径660μm的圆形ROI，并利用阈值分割将ROI进一步分为细胞角蛋白阳性（肿瘤）和间质区域，仅对肿瘤区域的照明区（AOI）进行紫外光切割以收集探针标签，用于后续测序文库构建。数据经过GeoMx NGS分析流程处理，并进行质量控制和定量下限（LOQ）评估。
对于RNAscope分析，使用VS Universal AP试剂盒和针对GATA3、SOX10、PD-L1 mRNA的探针进行检测，并以PPIB和细菌dapB mRNA分别作为阳性和阴性对照。染色后的切片经高分辨率扫描后，使用QuPath软件进行数字图像分析。在数字切片上放置与GeoMx ROI大小相同的TMA网格，通过像素分类排除污物和皱褶，进行细胞检测与分类（肿瘤、间质、淋巴），并利用亚细胞检测功能计数RNAscope信号点与簇，最终计算每个细胞的平均点数。
统计分析在RStudio中进行。将GeoMx的每个基因五个探针计数的几何平均数与RNAscope的每细胞点数进行Pearson相关性分析。将低于GeoMx定量下限或RNAscope每细胞0.1个点的数据视为阴性。
结果
GeoMx观察结果
在93个可用组织芯中，3个因质量不佳被排除。五个PD-L1探针中有两个未产生任何计数被排除。GATA3和SOX10的所有五个探针各自与RNAscope测得的表达量均显示良好相关性，但灵敏度存在差异，SOX10的两个探针读数显著偏低。最终保留了所有探针的计数用于分析。
RNAscope观察结果
阳性对照PPIB在所有组织芯中均显示足够表达。阴性对照dapB无背景信号。在GATA3、SOX10和PD-L1的检测中，分别有少量组织芯因无肿瘤细胞或技术问题被排除。最终，两种方法均有足够数据可用于分析的组织芯数量为：GATA3 89个，SOX10 83个，PD-L1 86个。
数字图像分析（QuPath）
视觉检查表明QuPath算法在大多数组织芯中正确分类了细胞。少数高表达核心中，部分间质和淋巴细胞被误分类为肿瘤细胞，导致RNAscope的点数被低估，对整体结果影响较小。亚细胞检测成功识别了大多数真实信号点，像素分类有效排除了显著伪影。
相关性分析
GeoMx与RNAscope的表达数据如图2所示。GATA3显示出强相关性（r = 0.87, 95% CI: 0.80–0.91），而SOX10的相关性稍弱（r = 0.77, 95% CI: 0.66–0.85）。GATA3和SOX10的回归线斜率存在明显差异（图3）。PD-L1仅在一个肿瘤核心中高表达，不适于进行相关性分析。
灵敏度
对于所有三种标志物，RNAscope均显示出比GeoMx更高的灵敏度和更宽的动态范围。在所有三个标志物的25个案例中，RNAscope检测到每细胞0.1至1个点的表达水平，而GeoMx的相应计数低于定量下限。有一个核心在GeoMx中显示低GATA3表达，但在RNAscope中为阴性。手动复查发现该核心存在一些数字图像分析未检测到的微弱信号点。
讨论
据我们所知，这是首个在临床标本FFPE肿瘤组织中检验并比较GeoMx与RNAscope相关性及性能的研究。两种方法在GATA3和SOX10上表现出强相关性。PD-L1因仅一例高表达而未进行相关性分析，但两种方法在高/低表达结果上一致。RNAscope在低靶标mRNA表达的组织芯中展现出更宽的动态范围和更高的灵敏度。
本研究优势在于采用QuPath进行客观、连续的RNAscope定量分析，并由专业病理学家监督；RNAscope重复实验增强了可靠性；GeoMx CTA每个靶标使用五个探针，提升了数据稳健性；组织保存时间短，降低了mRNA降解影响。局限性包括PD-L1阳性样本过少，GeoMx仅进行一次实验无法评估批间重复性，RNAscope信号放大、苏木精复染强度、组织形态以及焦点差异等因素可能引入定量误差，QuPath对信号簇的处理方式可能导致估算偏差。
在数据标准化方面，本研究仅使用细胞计数对GeoMx数据进行标准化，以匹配RNAscope的标准化方式。结果与早期有限研究一致。灵敏度差异可能源于GeoMx的检测下限，其需要一定数量的细胞和转录本才能可靠检测低表达基因。尽管RNAscope动态范围更宽，但在极高表达组织中可能存在信号饱和的上限，而GeoMx无此限制。
GATA3与SOX10回归线斜率的显著差异可能与RNAscope信号平台期、细胞误分类、或GeoMx/RNAscope探针本身及靶标mRNA状态有关。GeoMx CTA中两个PD-L1探针的失效，也提示了GeoMx全转录组图谱（WTA）中每个基因仅有一个探针可能存在的风险。
关于可重复性，本研究中的RNAscope SOX10检测在一次运行中信号明显偏弱，原因不明。而文献报道GeoMx在连续切片上表现出很高的可重复性。
结论
NanoString GeoMx CTA与RNAscope的数据具有强相关性。GeoMx能够在特定细胞群体中同时分析数千个基因的表达，是进行大规模转录组分析和生物标志物筛选的强大工具。相比之下，RNAscope则提供单细胞分辨率，具有更高的灵敏度及更宽的动态范围。方法的选择最终取决于研究的可及性与具体应用目标。
