《Journal of Biological Chemistry》：Evidence that non-cognate proteinogenic amino acids generate immunogenic neoepitopes
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这篇综述深入探讨了自然界中存在的非规范氨基酸（NCAAs）如何被整合进蛋白质，从而触发免疫应答的新机制。作者不仅总结了植物利用这类氨基酸进行化学防御（化感作用）的原理，还重点阐述了其在哺乳动物（包括人类）体内通过诱导蛋白质错误翻译，产生“新抗原”（neoepitopes）并激活免疫系统的最新实验证据。文章特别指出，这一过程为理解某些自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮）的环境诱因提供了新视角，并揭示了其在增强肿瘤免疫原性、开发新型癌症免疫疗法方面的巨大潜力。
氨基酸概论
生物体主要依赖20种DNA编码的规范氨基酸（AAs）来合成蛋白质。然而，自然界中存在数百种非规范氨基酸（NCAAs），其中许多是植物次级代谢产物。一些NCAAs被发现具有蛋白质源性，可以在哺乳动物蛋白质合成中模仿规范氨基酸。负责氨基酸识别的tRNA合成酶（aaRS）虽然能区分其他规范氨基酸，但可以激活与规范氨基酸结构高度相似的NCAAs。当这些蛋白质源性NCAAs被整合进蛋白质时，会导致产生高水平的“非天然”蛋白质，这可能对竞争植物或捕食者的健康产生负面影响。传统上，蛋白质源性NCAAs对人类健康的影响通常被归因于细胞内非天然、错误折叠蛋白质的积累，类似于植物化感作用的机制。然而，近年来越来越多的证据表明，蛋白质源性NCAAs具有产生免疫原性新表位（neoepitopes）的能力。
植物氨基酸
植物能产生多种不参与蛋白质合成的非规范氨基酸（NCAAs）。一些NCAAs是中心代谢的中间产物，普遍存在于大多数植物物种中。另一些则是次级代谢产物，通常分布零星，常为植物提供抵御害虫和病原体的保护。次级NCAAs的合成常受环境因素调控。其中，毒性最强的植物氨基酸是那些能够在蛋白质合成中模仿规范氨基酸的亚类，被称为蛋白质源性NCAAs。植物利用这类氨基酸对捕食者发动化学战，或抑制竞争植物的生长和生存。蛋白质源性NCAAs影响人类健康的程度目前知之甚少。大多数体外和体内研究都集中在与异常NCAA-containing蛋白质在细胞和组织中沉积相关的毒性上。但最近在生物体水平上的研究表明，蛋白质源性NCAAs可以因其存在于蛋白质中而产生新抗原，从而触发免疫反应。
蛋白质合成中的翻译错误
将遗传信息翻译成功能性蛋白质涉及三个不同的步骤，每一步都采用不同的策略来防止或限制错误。最高的错误率发生在翻译过程中，错误通常源于“误充电”，即氨酰-tRNA合成酶（aaRS）在tRNA的氨酰化过程中出错。典型的错误翻译率约为每104个氨基酸中出现1个错误，在细胞应激下可高达103分之一。由于氨基酸是小分子，底物与合成酶之间的接触点有限，使得区分变得困难。质量控制机制旨在最大限度地减少涉及同源规范氨基酸的自然错误，但翻译机制仍可能被NCAAs所利用。对于大约一半的aaRSs来说，其对同源与非同源氨基酸的特异性约为3000比1，这接近蛋白质合成的总体错误率。然而，剩余的aaRSs有“近同源”底物，并依赖编辑机制来校对非同源的规范氨基酸。
蛋白质合成中的氨基酸模拟
早在20世纪60年代，当首次系统研究NCAAs的毒性时，就发现许多NCAAs对细菌有生长抑制作用，这是由于它们被错误地整合进了蛋白质。蛋白质源性NCAAs可能是最早的毒素之一，因为它们可以破坏甚至最原始的、依赖蛋白质合成生存的生物体的生长。例如，羊茅草向土壤中释放间酪氨酸（meta-tyrosine），其在蛋白质合成中取代苯丙氨酸（Phe），从而抑制竞争植物的生长。生物体内保留的蛋白质源性NCAAs也可以阻止食草动物或病原体。进化出更具选择性的tRNA合成酶是宿主防御自身毒性的一种策略。例如，刀豆进化出一种精氨酰-tRNA合成酶，能够防止刀豆氨酸（canavanine）整合到其自身的蛋白质中。捕食者也可以采用这种策略。体内暴露于NCAAs通常只会适度增加非天然蛋白质的合成，而竞争性规范氨基酸的水平是决定非天然蛋白质合成程度的关键因素。虽然大多数细胞和组织能够耐受非天然蛋白质产量的适度增加，但分裂后细胞更为脆弱。
蛋白质模拟性非规范氨基酸的特征
只有当NCAAs在大小、形状和电荷上与规范氨基酸高度相似时，才会在蛋白质合成中发生模拟，因此较大的规范氨基酸更可能有符合这些标准的蛋白质源性模拟物。芳香族氨基酸的氧化形式，如邻酪氨酸（ortho-tyrosine）、间酪氨酸和3,4-二羟苯丙氨酸（DOPA）具有蛋白质源性，因为向芳香环添加氧分子对其大小、形状和电荷影响最小。NCAAs错误掺入新合成蛋白质是一个随机过程，其中NCAA和同源氨基酸竞争特定的aaRS。在蛋白质内部，每个残基被NCAA取代的几率是相等的。然而，替换溶剂暴露的（表面）残基对蛋白质三级结构的影响可能小于替换内部（埋藏）残基。NCAA的化学性质可以改变蛋白质的折叠、稳定性和功能，在蛋白质工程中广泛使用规范氨基酸被NCAAs进行的残基特异性和位点特异性替换。
非同源氨基酸产生的新表位
早在20世纪60年代，人们就认识到由肿瘤合成的突变蛋白质产生的肽段（称为新抗原）可以被识别为非我并刺激免疫反应。这构成了针对恶性肿瘤的免疫监视系统的一部分，其中主要组织相容性复合体（MHC）分子在细胞表面呈现肿瘤蛋白质组样本供T细胞检查。MHC I类蛋白展示由胞质蛋白质经蛋白酶体降解产生的肽段，而MHC II类蛋白呈现来自内体或溶酶体蛋白水解的肽段。呈现在MHC分子上并能诱导免疫力的新抗原肽段被称为新表位。只有一小部分新抗原能形成新表位。由于新抗原对免疫系统是外来的，新表位特异性T细胞不受中枢耐受的影响。
大多数癌症突变是非同义单核苷酸变异，其中单个核苷酸改变使密码子编码不同的规范氨基酸，从而产生规范新抗原。这类似于涉及NCAAs的翻译错误，其产生非规范新抗原。新表位的抗原性可以通过几种机制产生：非编码氨基酸残基的存在可能创建一个锚点，增加肽段对MHC分子的结合亲和力，从而增强针对免疫系统不耐受的新表位的呈递。或者，面向T细胞受体（TCR）结合位点的非编码氨基酸残基可以改变TCR结合特性，从而使T细胞能够识别。氨基酸替换也可能影响蛋白质加工和通过MHC加载区室的运输。此外，翻译错误可能产生错误折叠的蛋白质，暴露出在天然结构中通常隐藏的隐性表位，当暴露时，对免疫系统显得陌生。针对外源抗原和自身抗原的交叉反应性，称为分子模拟，被认为是许多自身免疫性疾病的机制。暴露于与宿主抗原有相似氨基酸序列或结构的外源抗原可引起自身免疫反应。针对NCAA新抗原的自身反应性也可能通过表位模拟发生，这需要NCAA-containing表位与宿主表位在主要氨基酸序列上有显著重叠，或具有结构相似性。
含NCAA的蛋白质新表位与免疫
刀豆氨酸诱导的系统性红斑狼疮
系统性红斑狼疮（SLE）是一种以产生自身抗体和免疫复合物在组织中沉积导致慢性炎症为特征的疾病。流行病学研究，包括涉及同卵双胞胎的研究，表明环境因素和遗传易感性都导致了SLE的发展。在人们使用苜蓿种子来降低血浆胆固醇水平后，报道了蛋白质源性NCAA刀豆氨酸与狼疮样综合征之间的潜在联系。苜蓿种子和芽中含有约2%（干重）的刀豆氨酸。刀豆氨酸是规范氨基酸精氨酸的紧密结构类似物，在许多生物系统中作为抗代谢物发挥作用。体外研究表明，刀豆氨酸可以取代蛋白质中高达30%的精氨酸残基，导致细胞凋亡。在喂食苜蓿芽的猴子中也观察到了SLE样综合征，这使Malinow及其同事提出免疫系统正在对“异常的刀豆氨酰蛋白质做出反应，从而产生自身抗体”。再次暴露于刀豆氨酸会使先前诱导出SLE样综合征的猴子疾病复发。也有报道称服用苜蓿片会加剧现有的SLE。在一篇综述文章中，Akaogi及其同事支持Malinow的自身抗体假说，并提出刀豆氨酸整合进蛋白质可能产生“自身蛋白质的免疫原性隐性表位”。他们的推理是，由于含有刀豆氨酸残基的异常错误折叠蛋白质被泛素化并经历蛋白酶体降解，含刀豆氨酰的肽段可以呈递在MHC I类分子上。此外，由于L-刀豆氨酸诱导细胞凋亡，含有刀豆氨酰蛋白质的凋亡细胞也有可能被吞噬并被内体蛋白酶加工，将刀豆氨酰新表位肽段加载到MHC II类分子上。
氮杂环丁烷-2-羧酸（A2C）
脯氨酸残基在蛋白质主链中起着独特作用，是蛋白质三级结构的主要决定因素。Lubec及其同事报告了大鼠口服蛋白质源性脯氨酸类似物后，肾脏基底膜IV型胶原免疫反应性的变化。氮杂环丁烷-2-羧酸（A2C）是一种来自甜菜的蛋白质源性脯氨酸类似物，已被证明会引起皮肤胶原蛋白和毛发结构的变化。Rubenstein推断，由于脯氨酸被NCAA取代可能导致蛋白质构象和免疫原性发生变化，髓鞘碱性蛋白（MBP）上产生的含A2C新表位可能作为多发性硬化症（MS）的免疫触发因素。这一假说得到了地理和时间关联的支持，即多发性硬化症发病率较高与人类接触A2C（与甜菜种植用于制糖及其作为奶牛饲料有关）。
证明NCAA-containing新表位具有抗原性的最重要突破是由Li及其同事实现的，他们利用肿瘤细胞中加速的蛋白质合成来增加异常含A2C蛋白质的生成。当使用脂质体纳米颗粒递送系统将A2C递送至肿瘤组织（4T1肿瘤同种异体移植物）时，错误翻译蛋白质的区域性生成增加了肿瘤免疫原性并促进了抗肿瘤免疫反应，显著延长了荷瘤小鼠的生存期。脾脏CD8+T细胞增加提示MHC I免疫反应，而CD80+和CD86+树突状细胞增加，后者为T细胞活化提供信号。
间酪氨酸增强免疫反应
间酪氨酸是羊茅草释放到土壤中的一种化感物质，用于抑制邻近植物的根系生长。它也能被哺乳动物细胞整合进蛋白质，并在体内具有有效的抗转移作用。间酪氨酸是苯丙氨酸氧化的产物，在体内以游离和蛋白质结合形式存在。当给予用脂多糖（LPS）处理的小鼠时，间酪氨酸可防止免疫抑制并恢复体液免疫反应。它的存在增加了LPS处理小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞的数量，并增加了程序性死亡配体1的表达，这是免疫抑制的关键标志物。对CD4+和CD8+T细胞的影响表明MHC I类和II类通路均被激活。间酪氨酸治疗还能抑制携带高转移性肿瘤小鼠的转移。此外，间酪氨酸可以在不产生直接抗肿瘤作用的情况下增强整体免疫反应，这表明免疫原性可以在低于产生细胞毒性效应所需的暴露水平下发生。
神经毒素β-甲氨基-L-丙氨酸（BMAA）
蓝藻NCAA α-氨基-β-甲氨基丙酸，通常称为β-甲氨基-L-丙氨酸（BMAA），在20世纪60年代末因其与南太平洋关岛居民一种复杂神经系统疾病的关联而受到关注。许多体外和体内研究，包括涉及灵长类动物的研究，都支持BMAA的神经毒性/兴奋毒性特性。BMAA以游离和“蛋白质相关”形式存在；然而，其与蛋白质关联的性质一直存在相当多的争论。基于使用放射性标记L-BMAA的体外竞争研究，有研究提出L-BMAA在蛋白质合成中取代L-丝氨酸。与此观察一致，后来显示L-丝氨酸在体外和体内可防止BMAA毒性。但BMAA-丝氨酸交换的观点受到质疑，因为其他研究者无法在蛋白质中检测到BMAA。事实上，使用分离的人tRNA合成酶的研究表明，BMAA是人丙氨酰-tRNA合成酶的底物，而不是人丝氨酰-tRNA合成酶的底物。在小鼠皮层神经元中，发现BMAA激活先天免疫，增加Toll样受体表达，并促进已知是先天免疫介质的趋化因子和细胞因子的产生。
某些结直肠癌中缺乏肿瘤特异性抗原蛋白是免疫疗法面临的挑战。为了解决这个问题，Tian及其同事测试了BMAA在小鼠结直肠癌模型中人工引入新抗原的能力。BMAA治疗抑制了肿瘤生长，并激活了树突状细胞（CD80+和CD86+）以及CD8+T细胞反应。在这些研究中，BMAA被证明在体外和体内被误掺入蛋白质，特别是在丝氨酸位点。尽管掺入水平很低，但BMAA治疗显著减小了肿瘤大小，并表现出较低的系统毒性。作者认为，生成含BMAA的新表位可能是一种在不破坏全身免疫平衡的情况下打破免疫耐受的有价值的方法。
左旋-3,4-二羟苯丙氨酸（L-DOPA）
L-DOPA（左旋多巴）是L-酪氨酸的紧密结构类似物，是神经递质多巴胺的直接代谢前体，50多年来一直用于纠正帕金森病（PD）中多巴胺能神经元丢失导致的多巴胺缺乏。帕金森病患者可能暴露于相对高水平的这种NCAA，在尸检的帕金森病脑中也报道了含DOPA蛋白质的水平升高。据报道，左旋多巴治疗可增加细胞因子白介素-1的合成，并增加患者血浆中的IgM和IgA水平，这使作者认为左旋多巴对免疫系统细胞具有选择性作用。此外，有几例与L-DOPA治疗相关的异常低血小板（血小板减少症）的病例报告，伴有抗红细胞抗体（库姆斯试验）阳性反应或抗核抗体试验阳性反应发生率增加。通常，免疫反应在DOPA治疗患者中似乎是罕见事件，但有趣的是，确定少数对DOPA产生免疫反应的患者是否会从补充酪氨酸中受益，以防止或减少其整合到蛋白质中。
结论
这篇综述提出的证据表明，蛋白质源性NCAAs可以刺激一定程度的免疫反应。这一结论主要基于动物研究的观察结果和人类暴露后的报告，而非来自靶向免疫学研究。然而，这一原理现已被有效地用于增强肿瘤免疫原性并延长小鼠癌症模型的动物生存期。免疫检查点抑制剂（ICIs）的发展代表了免疫疗法的一个重大进步，可防止癌细胞逃避免疫监视。蛋白质源性NCAAs与ICIs结合使用以增强肿瘤抗原性具有巨大潜力，特别是对于那些突变负荷低、对免疫疗法基本无效的癌症。化疗也可用于通过诱导肿瘤基因突变来增加新抗原，但可能导致正常细胞和骨髓的不可逆基因突变。基于全外显子组测序和MHC亲和力预测设计的个性化肿瘤疫苗价格昂贵，并且由于依赖单一肿瘤抗原，其有效性往往有限。而NCAAs诱导的蛋白质错误翻译提供了一种同时生成多种肿瘤新抗原的方法。然而，目前尚不清楚哪些NCAAs能提供最有效的治疗效果。
肿瘤中较高的蛋白质合成速率将增加NCAAs反应下原位产生新抗原的速率，同时可以通过提供足够水平的母体氨基酸来与NCAA竞争tRNA合成酶，从而减少全身性影响。短期或间歇性治疗有可能用于最大限度地减少NCAA暴露带来的不良影响。将NCAAs靶向实体瘤（如小鼠研究中所用）也可以最大限度地减少对其他组织的损害，局部用药可能是皮肤癌局部治疗的一种选择。
关于蛋白质源性NCAAs能够刺激强烈免疫反应的特性，仍有许多未解之谜。结构研究表明，肿瘤产生的新表位仅需与野生型对应物略有不同即可在患者中具有免疫原性。大约10%的免疫原性表位是线性的，由蛋白质序列中连续残基形成的短肽组成，其余的是构象表位，由折叠蛋白质三维结构内空间邻近的残基组成。通常，极性基团、疏水基团、芳香族残基和反应性侧链可增强结合和抗原性，但使用计算方法预测免疫原性，特别是构象表位的免疫原性，取得的成功有限。
间酪氨酸在小鼠模型中诱导了全身免疫反应，但未观察到对肿瘤生长的影响，这表明低水平环境暴露于蛋白质源性NCAAs可能在不出现其他毒性效应的情况下刺激宿主免疫反应。A2C存在于饲料甜菜和甜菜粕中，后者是较冷国家奶牛常用的冬季饲料，已被认为是多发性硬化症的免疫触发因素。三项独立研究报告了多发性硬化症发病率与牛奶消费量之间的强相关性。考虑到身体生长、牛奶摄入量和髓鞘形成在婴儿期都处于最高水平，通过摄入的牛奶中的A2C取代脯氨酸来修饰MBP，可能会嵌入免疫原性表位，在以后的生活中触发针对MBP的免疫反应。这与将多发性硬化症风险与儿童期居住地联系起来的观察结果一致。
我们对蛋白质源性NCAAs生成的新表位引起的免疫反应的理解尚处于早期阶段，但这是一个重要的新兴领域，对癌症治疗和理解偶然环境暴露于NCAAs相关的潜在健康风险具有重大意义。需要进一步的研究来阐明这些免疫反应背后的机制，确定哪些NCAAs最有可能影响肿瘤抗原性，并确定其安全谱。临床前研究对于优化给药策略和评估毒性至关重要，从而为未来的临床应用提供信息。
