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该研究开发了一种基于近红外二区（NIR-II）光活化的双靶向纳米探针平台，通过透明质酸修饰的Fe3O4纳米颗粒特异性捕获循环肿瘤细胞（CTCs），随后加入叶酸修饰的金掺杂硫化镉纳米颗粒和铜离子生成硫化铜复合材料，实现光热信号和压力信号的协同检测，检测灵敏度达5 cells/mL，范围覆盖10-10^5 cells/mL，为便携式CTCs检测提供新方案。
Suisui He|Min Tian|Qiao Yu|Jun Yin|Zhonghui Luo|Sha Liu|Xiaofei Liu|Jun Wang|Hua Wei|Cui-Yun Yu
中国南方大学衡阳医学院药学院分子靶向新药研究湖南省合作创新中心，湖南衡阳421001
摘要
循环肿瘤细胞（CTCs）是早期癌症转移的首个指标，因此对于早期癌症诊断、治疗反应监测和预后评估至关重要。然而，由于CTCs在外周血液中的数量极低且容易受到其他血液成分的干扰，其临床检测往往受到限制。为了满足同时高效捕获和灵敏检测CTCs的实际需求，我们报道了一种基于双靶向纳米探针的第二近红外（NIR-II）光激活纳米平台，该平台能够进行两步顺序操作。具体而言，使用具有特异性识别能力的透明质酸修饰的氧化铁纳米颗粒（HA@Fe3O4）首先从全血样本中分离并收集CTCs。随后原位添加叶酸修饰的硫化镉纳米颗粒（FA–Au@CdS）和铜离子，生成硫化铜复合材料，作为双信号响应纳米传感器，用于超灵敏定量检测CTCs。这些纳米传感器不仅通过离子交换反应产生光热信号，还利用信号转导策略产生时空压力信号，从而实现了从10到105细胞/mL的宽检测范围和低至5细胞/mL的检测限的双模式便携式CTCs检测。通过分析人全血中的三阴性乳腺癌细胞，进一步验证了该多功能纳米平台的实用性和效率。本研究开发了一种简便、可扩展且可转化的方法，用于高效同时富集和准确检测CTCs，具有实际应用价值。
引言
癌症仍然是威胁全球人类生命和健康的主要疾病之一[1]、[2]、[3]、[4]。据估计，约90%的癌症相关死亡是由原发肿瘤的转移引起的[5]。在肿瘤转移过程中，癌细胞可能从原发肿瘤的细胞外基质中脱离并进入循环系统；这些细胞被称为循环肿瘤细胞（CTCs）[6]。由于CTCs在基因组信息和蛋白质表达谱方面与原发肿瘤高度相似，因此它们成为早期诊断、治疗反应监测和预后评估的宝贵生物标志物，特别是在肿瘤异质性和个体间显著差异的情况下[7]。迄今为止，只有CellSearch系统获得了美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床检测CTCs[8]。然而，这种方法存在捕获纯度低（<1%）、白细胞背景干扰大以及在遗传或细胞学分析前需要样本富集的问题，因为外周血液中CTCs的浓度极低（<10细胞/mL）[9]。因此，开发一种高效可靠的从全血样本中同时分离和检测CTCs的技术仍然是当代临床实践中的关键挑战。
目前的CTCs检测主要依赖于大规模科学仪器，如单细胞测序平台和微流控集成设备，这些设备还需要昂贵的试剂和耗材[10]、[11]。这些限制严重阻碍了CTCs检测在初级医疗环境和现场诊断场景中的广泛应用[12]。因此，开发一种快速、便携且准确的即时检测（POC）平台对于推进CTCs检测的实际应用至关重要。最近在基于简单信号输出（如温度、压力、pH值和距离）的便携式检测技术方面取得了一些进展[13]、[14]、[15]。这些技术通常只需要简单的便携设备，包括葡萄糖仪、温度计、压力计和pH计，因此能够在资源有限和移动环境中实现实时和现场诊断，因为它们价格便宜且易于操作[16]。在这些便携设备中，基于压力信号的检测方法因其出色的便携性、高灵敏度和独立于外部电源而受到广泛关注[17]。大多数报道的基于压力信号的检测技术依赖于过氧化氢（H2O2）的催化分解产生氧气（O2），从而增加密封系统内的内部压力并实现信号获取[18]、[19]、[20]。然而，H2O2本质上不稳定，容易自发分解，可能导致系统完全密封之前发生反应，从而影响检测准确性[21]。此外，单信号读数容易受到环境因素、操作员熟练程度和仪器差异的干扰，可能会影响结果的可靠性[22]、[23]。为了提高检测准确性，开发一种利用两种不同机制的独立信号的双模式传感策略将有助于通过交叉验证提高检测结果的可靠性和稳健性[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]。这种方法通过提供更准确和全面的诊断信息，为实时POC检测提供了显著优势。
光热检测作为一种环境友好的分析方法，利用光热剂独特的光热转换特性，有效地将光能转化为热能[31]、[32]。这一过程在目标分析物和产生的温度变化之间建立了可测量的相关性，使得使用便携式温度计或红外热成像设备进行测量变得方便，而无需依赖复杂的仪器[33]。光热分析在POC检测中显示出巨大潜力，主要得益于几个显著优势：（i）高信噪比，不受基质组成或背景颜色的影响；（ii）通过光热效应产生的温度信号变化对环境温度波动具有很强的抵抗力；（iii）使用简单、成本低廉且用户友好的设备，无需专业操作员；（iv）能够实现精确的时空控制[34]、[35]。目前，大多数传统光热剂在可见光（400–700?nm）和第一近红外（NIR-I，700–900?nm）光谱区域具有强吸收[36]。尽管NIR-I光在体内光热诊断和治疗中具有更大的穿透深度，但其散射效应仍然是一个限制，影响组织穿透[37]。相比之下，第二近红外（NIR-II，900–1700?nm）光的散射显著减少，使得在血液、脂肪和皮肤等复杂生物环境中背景干扰最小，信号特异性提高，检测速度加快[38]、[39]。值得注意的是，在NIR-II光照射下，将光热效应诱导的温度信号转换为压力信号不仅能够开发多模式传感机制，还能在压力测量中实现额外的时空控制。最近，Wang等人合成了叶酸（FA）修饰的金纳米框架，用于放大癌细胞检测的压力和温度双信号输出[40]。为了增强靶向识别效果，Tang等人开发了基于双适配体的多巴胺修饰的硫化镉纳米片，可以同时使用便携式压力计和智能手机读取压力和温度信号[41]。受这些先前进展的启发，我们最近报道了利用温度和压力信号的透明质酸（HA）修饰的硫化镉纳米复合材料，用于快速、可靠和便携地检测癌细胞[42]。然而，当前的方法通常仅限于单信号输出或不稳定的H2O2依赖的催化反应系统，这在一定程度上限制了在POC检测中获得更精确和全面数据的能力。
为了满足快速、便携和高灵敏度POC检测的要求，已经应用了各种定制策略来提高纳米传感器的性能，包括界面设计、多信号响应机制、级联信号放大和设备制造[43]、[44]、[45]。硫化铜纳米颗粒（CuS NPs）作为一种成本效益高且高效的光热剂，相比贵金属基纳米材料（如金纳米棒和纳米笼）具有多个优势，包括合成简单、生产成本低、生物降解性好以及出色的光热性能，使其更具临床转化前景[46]。此外，CuS NPs具有优异的光稳定性，并且在广泛的光热转换效率方面不受环境条件或所用溶剂的影响[47]。在开发理想纳米传感器时，另一个关键挑战是将具有高亲和力的功能单元与有效捕获目标分析物的功能整合[48]。目前，CTCs通常使用抗体、适配体、DNA探针或小分子配体进行识别。基于抗体的免疫染色仍然是CTCs检测的标准方法，主要依赖于细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子和CD45等标记物进行识别[49]、[50]。与生物来源的抗体相比，有机分子配体（如FA、HA和苯硼酸）通常具有更高的稳定性、更低的生产成本以及在CTCs检测中更大的化学修饰灵活性[51]。据我们所知，同时具有特异性识别能力并能够同时捕获和感知CTCs的双模式便携式纳米平台很少被探索。
为此，我们开发了一种基于双靶向纳米探针的NIR-II光激活纳米平台，能够进行两步顺序操作（方案1）。具体而言，具有特异性识别能力的透明质酸修饰的氧化铁纳米颗粒（HA@Fe3O4）首先从全血样本中分离并收集CTCs。随后原位添加叶酸修饰的硫化镉纳米颗粒（FA–Au@CdS）和铜离子，生成CuS复合材料，作为双信号响应纳米传感器，用于超灵敏定量检测CTCs。值得注意的是，这些纳米传感器不仅通过离子交换反应产生光热信号，还通过信号转导策略产生时空压力信号，从而实现了在人全血中检测三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）的高灵敏度和可靠性。因此，所提出的双模式传感平台为CTCs的同时富集和检测提供了一种成本效益高且方便的方法，从而弥合了实验室传感器和临床应用之间的差距。
试剂和材料
三钠柠檬酸二水合物（C6H5Na3O7•2H2O，99%）、氯金酸三水合物（HAuCl4•3H2O，99.9%）、透明质酸（HA，10–50?kDa）和l-抗坏血酸（C6H8O6，99%）来自HWRK CHEM。氯化镉水合物（2(CdCl2)•5H2O，99%）、六水合三氯化铁（FeCl3•6H2O，99.5%）、四水合二氯化亚铁（FeCl2•4H2O，98%）、氢氧化钠（NaOH，99%）、硫脲（NH2CSNH2，99%）、氨（NH3•H2O，28%–30%）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP，55?kDa）来自Energy Chemical。
材料表征
CdS纳米颗粒是根据先前报道的程序[43]使用一锅法合成的。然后利用PVP对金离子的结合亲和力和抗坏血酸的还原能力，将金纳米颗粒（Au NPs）均匀沉积在CdS纳米颗粒表面，得到Au@CdS纳米颗粒。使用SEM和TEM对Au@CdS的形态进行了表征。Au@CdS纳米颗粒表现出分散良好的球形形态，平均粒径为
结论
总结来说，我们开发了一种基于双靶向纳米探针的NIR-II光激活纳米平台，能够进行两步顺序操作。具有特异性识别能力的HA@Fe3O4纳米颗粒首先从全血样本中分离并富集CTCs。随后添加FA–Au@CdS和CuCl2，触发原位形成CuS复合材料，作为双信号纳米传感器，用于超灵敏定量检测CTCs。这些纳米传感器不仅通过离子交换反应产生“开启”的光热信号，还通过信号转导策略产生时空压力信号，从而实现了对人全血中三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）的高灵敏度和可靠性检测。因此，所提出的双模式传感平台为CTCs的同时富集和检测提供了一种成本效益高且方便的方法，从而弥合了实验室传感器和临床应用之间的差距。
CRediT作者贡献声明
Suisui He：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。Min Tian：撰写 – 原稿撰写、可视化、验证、软件、资源、方法学、调查、正式分析、数据管理。Qiao Yu：正式分析、数据管理。Jun Yin：正式分析、数据管理。Zhonghui Luo：正式分析、数据管理。Sha Liu：正式分析、数据管理。Xiaofei Liu：正式分析、数据管理。Jun Wang：撰写 –
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国南方大学（191RGB001，Hua Wei）、国家自然科学基金（22101127）、湖南省科技创新领军人才项目（2022RC3080）、湖南省重点研发计划（2021SK2036）、湖南省自然科学基金（2023JJ40529、2023JJ50254、2023JJ50277和2024JJ6373）以及湖南省教育厅基金（24B0418和23B0704）的支持。
