BmPriL对家蚕丝腺发育的影响

《Journal of Insect Physiology》：Effect of BmPriL on the development of silk glands in silkworm

silkworms中，通过过表达BmPriL和CRISPR/Cas9敲除技术，发现PriL调控丝腺细胞增殖和丝蛋白合成。过表达增加丝腺大小和产量，敲除则减少。机制涉及eIF3亚基下调。该研究揭示了PriL在丝绸生产中的分子机制。

　　

HuaiRong Lin|Nuo Chen|Xiaohan Jiang|Shuxin Qiu|Niewang Ju|Qingyou Xia|Liang Jiang|Huizhen Guo

中国西部种质资源创新中心（重庆）科学城，西南大学生物科学研究中心，重庆400716，中国

摘要

丝蛋白具有重要的经济价值。蚕的丝腺是唯一能够合成和分泌丝蛋白的器官。Ser1（Ser1P）和Fib-H启动子（FibHP）分别在中部丝腺（MSG）和后部丝腺（PSG）中表达。primase大亚基（PriL）参与DNA复制。然而，它在调节丝腺发育中的作用及其潜在机制仍不清楚。在本研究中，我们构建了转基因载体pb-MOE和pb-POE，在这些载体中，BmPriL分别在Ser1P和FibHP的控制下过表达。通过胚胎显微注射方法获得了相应的转基因品系M–OE和P-OE。与对照组蚕相比，M–OE和P-OE蚕的BmPriL含量、丝腺长度和重量以及丝腺细胞的表面积和DNA含量显著增加。使用CRISPR/Cas9技术敲除了MSG和PSG细胞中的BmPriL，相应的品系分别称为M–KO和P-KO。M–KO和P-KO的表现与M–OE和P-OE相反。转录组分析和qPCR验证显示，敲除品系与对照组蚕在丝蛋白基因表达水平上没有明显差异。真核生物翻译起始因子3（eIF3）的H、F和G亚基在M–KO和P-KO中显著下调。这些结果表明，BmPriL的敲除减少了eIF3的表达，从而抑制了丝蛋白的合成并降低了产丝量。

引言

Bombyx mori是一种具有经济价值的产丝昆虫。丝蛋白广泛应用于纺织、服装、美容化妆品、生物医学等领域。丝腺（SG）是蚕体内唯一能够合成和分泌丝蛋白的器官（Wani等人，2020年；Xia等人，2004年）。根据不同的形态结构和功能，丝腺分为四个部分：前部丝腺（ASG）、中部丝腺（MSG）和后部丝腺（PSG）（Xia等人，2014年）。MSG主要分泌丝胶蛋白，包括丝胶蛋白-1（Ser1）、丝胶蛋白-2（Ser2）和丝胶蛋白-3（Ser3）（Couble等人，1987年）。PSG是丝腺中最长且最曲折的部分，分泌丝素蛋白，包括重链（Fib-H）和轻链（Fib-L）蛋白以及P25（Chevillard等人，1986年；Sprague，1975年；Yamaguchi等人，1989年）。在纺丝过程中，从PSG分泌的丝素蛋白在流经MSG时被丝胶蛋白包裹，随后由ASG压缩并结晶，最终从喷丝头中分泌出来形成丝体外（Valluzzi等人，1999年）。

蚕的丝腺发育分为两种不同的模式。在胚胎阶段，丝腺细胞经历大约10次有丝分裂，分化为MSG和PSG，并在胚胎发生第8天形成完全发育的丝腺组织，此时有丝分裂停止（Dhawan和Gopinathan，2003年）。在幼虫阶段，丝腺细胞仅通过核复制增加DNA含量（Chunduri等人，2022年；Zhang等人，2012年）。内周期是有丝分裂周期的一种变体，仅复制DNA并重复G1-S阶段，形成多倍体细胞（Lilly和Duronio，2005年）。在丝腺中过表达Yorkie或Myc可以促进丝腺细胞的核复制，增加DNA含量和丝蛋白表达，从而提高产丝量（Qian等人，2021年；Zhang等人，2017年）。然而，丝蛋白合成和腺体发育的潜在机制仍大部分未知。需要进一步的研究来确定参与这一过程的基因。

primase大亚基（PriL）是Polα–Primase复合体（Pol–Prim）的一部分，参与DNA复制。PriL和PriS协同作用合成初始二核苷酸，这些二核苷酸在5′–3′方向上延伸形成7–10个核苷酸的短链RNA引物（Eki等人，1991年）。PriL将RNA引物运输到Polα，后者进一步扩展RNA引物形成短链RNA–DNA引物（Sheaff和Kuchta，1993年）。这些引物是引导链和滞后链复制的起点，启动DNA合成（Copeland和Wang，1993年；Waga和Stillman，1998年）。PriL通过其C末端[4Fe-4S]簇稳定引物酶的结构，从而提高引物酶的连续合成能力和引物延伸效率（Frick和Richardson，2001年）。PriL促进肿瘤生长，并初步被确定为肺癌基因、生存率和预后的生物标志物（Mu等人，2021年）。在胰腺导管腺癌（PDAC）细胞中敲低PriL可抑制细胞增殖、迁移和DNA复制能力（Yin等人，2024年）。二氢青蒿素通过抑制PriL表达诱导肺癌细胞发生铁死亡，而在体外条件下，PriL过表达可以逆转这一效应（Ba等人，2012年；Yuan等人，2020年）。p53肿瘤抑制基因的突变导致PriL异常高表达，促进DNA复制和错配修复，激活细胞周期（Wang等人，2022年）。

推测PriL参与丝腺的发育。在本研究中，我们旨在使用转基因和基因编辑技术在MSG和PSG细胞中特异性过表达和敲除PriL，并进行表型分析和转录组测序以探讨其潜在机制。

部分摘要

蚕品系

Bombyx mori的Dazao（DZ）品系由中国西部种质资源创新中心（重庆）科学城保存。这些蚕在12小时光照、12小时黑暗、25°C和75%相对湿度的条件下饲养在桑叶上。

BmPriL的序列分析和表达模式检测

基于包含BmPriL的公共序列（GenBank：XM_004929157.5），我们使用PriL-FL引物克隆了BmPriL的CDS。对蚕、人类和拟南芥的PriL进行了序列比对分析。

BmPriL的序列比对和表达模式分析

克隆的1473 bp BmPriL CDS编码490个氨基酸，包含一个DNA_primase_lrg结构域（图S1A）。序列比对显示，PriL在蚕、人类和拟南芥中具有高度同源性（图S2）。系统发育分析表明，BmPriL与Manduca sexta的PriL关系最为密切（图S3）。qPCR结果显示，BmPriL在蚕的睾丸和PSG中的表达水平明显高于其他组织（图S1B）。在MSG（图S1C）和PSG（图

讨论

PriL参与DNA复制并具有重要的生物学功能。在本研究中，我们证明了BmPriL调节蚕的丝腺发育和丝蛋白合成，并分析了其潜在机制。

在MSG和PSG中过表达BmPriL显著促进了DNA复制，使丝腺细胞增大，并增加了丝蛋白的产生。在PSG中敲除BmPriL导致DNA复制减少，丝腺细胞形态紊乱，并显著降低了

CRediT作者贡献声明

HuaiRong Lin：撰写——原始草案，研究。Nuo Chen：研究，数据管理。Xiaohan Jiang：研究。Shuxin Qiu：方法学。Niewang Ju：数据管理。Qingyou Xia：资金获取。Liang Jiang：资源，项目管理，资金获取。Huizhen Guo：撰写——审阅与编辑，验证，监督，正式分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（编号：2022YFD1201600）和重庆市技术创新与应用发展计划（CSTB2024TIAD-KPX0026，CSTB2024TIAD-KPX0023）的资助。