综述：新兴力量：从冷冻电子断层扫描技术的发展到原位结构生物学研究

《Journal of Molecular Biology》：Rising Stars: From the Development of Cryo-Electron Tomography to In Situ Structural Biology Research

三维生物大分子近天然环境结构解析与动态功能研究，通过创新性冷冻电镜断层成像技术体系突破样本制备、数据采集与重建瓶颈，建立GPU加速图像配准、缺失楔形补偿算法、原位冷冻样本制备及AI辅助粒子筛选的全流程技术方案，推动在位结构生物学向细胞与组织尺度发展。

　　

作者：朱云、张岩、李硕果、孙飞

中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室，北京，中国

摘要

解析生物大分子在接近其天然环境下的三维结构及其动态功能，以揭示生命活动机制，是结构生物学的核心目标。在过去二十年里，孙飞实验室专注于创新冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术——这项技术是原位结构生物学的基石。他们在整个技术流程中取得了多项突破：开发了用于倾斜序列对齐和三维重建的软件，设计了算法来解决“缺失楔形”问题，优化了细胞和组织的样品制备方法，升级了冷冻相关光电子显微镜（cryo-CLEM）系统，并设计了人工智能辅助的粒子挑选方法。这些创新使他们能够阐明多种生物大分子的原位结构和功能。未来，他们将继续突破样品保真度、数据自动化和临床应用方面的瓶颈，推动原位结构生物学的发展，从而更深入地探究生命活动的奥秘。

引言

在过去几十年中，结构生物学在解析大分子结构及其功能机制方面取得了显著成就。冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的迅速发展，尤其是单粒子分析（SPA）的“分辨率革命”，将生物大分子复合物的结构研究推向了前所未有的高度。然而，传统的结构生物学严重依赖于样品的分离和纯化过程。这一过程常常会破坏生物分子在细胞内微环境中的天然状态，或导致天然环境信息的丢失，最终在分子结构与细胞生理功能之间形成了难以逾越的“鸿沟”[1]。因此，在接近生物大分子天然生活环境的条件下解析其三维（3D）结构及其动态功能，从而揭示生命活动的内在机制，已成为结构生物学领域的核心目标之一[2]。

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术的发展为原位结构生物学研究提供了革命性的解决方案[3]。该技术包括生物样品的玻璃化处理，随后进行冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削、倾斜序列采集、图像对齐和断层图重建，最终获得超微结构信息。它能够在接近天然生理条件的情况下，对细胞甚至组织内的生物大分子进行结构分析，生成细胞内超微结构的“全景视图”。因此，它为“结构细胞生物学”和“视觉蛋白质组学”等新兴领域的发展奠定了核心技术基础[4, 5, 6]。然而，cryo-ET的大规模应用长期以来受到多种瓶颈的制约，这些瓶颈严重限制了其分辨率的提升和应用范围。为了克服这些技术障碍，我们在过去二十年里一直致力于cryo-ET技术的创新和优化，对其整个技术流程进行了系统的研究。我们已经成功实现了多种重要生物大分子复合物的原位结构研究和功能解析。

技术进展概述

我们研究的起点：电子断层扫描的初步应用

自我们的研究团队成立以来，我们就认识到电子断层扫描（ET）是连接细胞生物学和结构分子生物学研究的重要桥梁，具有巨大的发展潜力。2009年，我们发表了第一篇关于ET的研究论文，并首次在中国建立了基于超薄切片的技术系统[7]。该研究以猪主动脉内皮（PAE）细胞为研究对象，系统分析了其三维结构。

倾斜序列对齐算法的开发

为了解决当时重建算法种类有限以及缺乏并行计算实现（如IMOD [8]、TomoJ [9]、UCSF Tomography [10]）的问题，这些因素限制了大规模数据重建的效率，我们在2011年开发了一款基于图形处理单元（GPU）加速的软件ATOM [11]（图2）。其主要功能包括二维对齐、重建参数估算、三维重建和二维图像可视化。

三维重建算法的开发

冷冻电子断层扫描的一个主要瓶颈在于由于数据采集范围有限（仅限于狭窄的角度范围），导致重建过程中信息丢失（图2）。重建结果的傅里叶变换会显示出高角度区域的楔形缺口，这种现象被称为“缺失楔形”问题。这一问题会导致重建结果在Z方向上出现各向异性伪影，从而影响分辨率。现有的重建算法（如代数重建技术ART [17]）未能有效解决这一问题。

原位样品制备方法的发展

冷冻电子断层扫描通常要求样品厚度小于300纳米，但大多数细胞和组织样品的厚度超过了这一要求，因此迫切需要开发样品冷冻减薄技术。玻璃化切片冷冻电子显微镜（CEMOVIS）是一种常用的方法，但它容易导致样品损伤且效率较低。早在2012年，我所在的中国科学院生物物理研究所生物成像中心就已经配备了双束扫描电子显微镜。

冷冻相关光电子显微镜技术的发展

生物样本中的许多分子在特定时间会定位于特定的细胞区室中。传统的冷冻FIB样品制备方法难以捕获这些目标分子，导致成功率较低。特定的荧光标记技术可以有效检测电子显微镜样本中的目标分子，而由此产生的相关光电子显微镜（CLEM）技术则实现了精确的原位样品制备。2017年，我们使用荧光标签对SNPH进行了标记。

人工智能辅助粒子挑选方法的发展

随着电子显微镜性能的提高和冷冻电子断层扫描技术的发展，亚断层图平均分析（STA）技术能够解析目标分子的中高分辨率原位结构。因此，从三维断层图中识别生物大分子颗粒对于原位结构分析至关重要。为了达到亚纳米级分辨率，通常需要挑选大量颗粒[48]，如果手动完成这一过程将非常耗时且费力。现有的自动化粒子挑选方法可以显著提高效率。

技术应用：生物大分子的原位结构研究

近年来，基于冷冻电子断层扫描的原位结构研究技术不断发展和完善。凭借长期的技术积累，我们建立了一套完整的工作流程，涵盖了原位冷冻电子显微镜样品制备、数据采集和数据分析，并利用这套流程对多种重要生物大分子进行了结构和功能研究。

对于病毒和细胞器样本，可以直接收集冷冻电子断层扫描数据，而无需进行冷冻FIB减薄处理。

未来方向

目前，基于冷冻电子断层扫描的原位冷冻电子显微镜技术在解析多组分复合物的结构、揭示生物大分子的原位功能机制以及重建细胞和组织内的整体分子景观方面展现了不可替代的优势。结构生物学已经超越了传统的分子结构生物学，深入发展到细胞和组织层面的原位结构研究，形成了一个新的研究方向。

作者贡献声明

朱云：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化制作。张岩：撰写——审稿与编辑、可视化制作。李硕果：可视化制作。孙飞：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、监督工作、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能会影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢孙飞实验室的所有前成员和现任成员的贡献，包括翟玉佳、朱云、张岩、庞晓云、孙瑞刚、陈连婉、张同明、江海丽、侯国江、顾同念、王玉清、赵一民、李伟民、李道义、欧阳竹青、周强军、霍彦武、胡忠军、徐英志、张凯、马军、高炳全、王胜柳、卢久伟、邱彪、邓宇晨、陈文博、张丹阳、史阳、牛同新、孙芳、春梅。