《Journal of Molecular Structure》：A Coumarin-Based Probe for Ultrafast Visual Detection of HClO/ClO- in Environmental and Biological Systems
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基于 coumarin 框架设计的新型荧光探针 CMA-ClO 可高效检测 HClO/ClO?，在 DMSO/PBS 溶液中灵敏度达 0.687 nM，响应时间 <3 秒，具有环境水样检测和活细胞成像应用价值。
张浩|何坤|栾明清|张洪硕|张明伟|葛超超|李秀芳|丁格|司万彤|王新超
山东临沂大学生命科学学院，中国临沂276000
摘要
HClO/ClO-是一种活性氧（ROS），具有强氧化性和抗菌性。过量的HClO/ClO-分泌会破坏高尔基体的结构和功能，从而导致包括阿尔茨海默病、神经退行性疾病和自身免疫性疾病在内的多种疾病的发病机制。因此，及时有效地检测HClO/ClO-及其衍生物具有重要的实际意义。在这项研究中，设计并合成了一种基于香豆素框架的新型“开启型”荧光探针，称为CMA-ClO。当加入HClO/ClO-衍生物时，该探针会因硼酸酯基团的断裂而表现出荧光增强特性。在DMSO/PBS（体积比1:1，pH 7.4）溶液中，CMA-ClO显示出高灵敏度（检测限为0.687 nM）、小于3秒的快速响应时间、对潜在干扰物质的高选择性以及出色的pH稳定性。通过准确量化环境水样（包括自来水、黄河水和地下水）中的HClO/ClO-，以及使用便携式试纸进行半定量视觉检测，验证了其实际应用性。此外，CMA-ClO具有较低的细胞毒性，并成功用于活细胞系（HT-29和CT-26）中外源HClO/ClO-的荧光成像。这些发现凸显了CMA-ClO作为环境监测和生物传感工具的潜力。
引言
次氯酸（HClO/ClO-）在生理和病理过程中的重要性在各个领域日益受到重视。作为一种重要的活性氧（ROS），HClO/ClO-在生物体内扮演多种生物学角色，包括免疫防御、细胞信号传导和抗菌功能。然而，HClO/ClO-水平的失调可引发多种病理状况，如动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、神经退行性疾病和癌症[[1], [2], [3]]。因此，开发可靠且灵敏的检测方法以在环境和生物学环境中检测HClO/ClO-对于理解其生理作用和诊断相关疾病至关重要[[4], [5], [6]]。
目前的HClO/ClO-检测方法包括电化学分析、色谱法、化学发光和荧光探针技术。相比之下，基于小分子的荧光探针具有显著优势，如高灵敏度[7,8]、快速响应、强选择性、广泛的应用性[9,10]、优异的生物相容性[11], [12], [13]以及实时监测能力[14]。多年来，已经开发了许多基于不同机制（包括FRET、比率荧光和双光子成像）的HClO/ClO-检测探针[[15], [16], [17]]。然而，许多探针仍面临挑战，如背景信号干扰、光毒性、与其他活性物质的交叉反应以及在分析物浓度升高时的非线性响应，这些限制了它们在复杂生物系统中的实际应用[18]。因此，利用荧光探针对环境处理和生物系统中的HClO/ClO-进行实时检测成为一个重要的研究方向[19,20]。有机小分子荧光染料（如罗丹明、香豆素、萘酰亚胺、BODIPY、吲哚菁绿等）因其优异的光学特性而被成功用于荧光探针的构建，并已成功应用于某些疾病的诊断和特定物质的监测[[21], [22], [23]]。针对HClO/ClO-设计的荧光探针可以根据其荧光响应机制进行分类，例如依赖氧化反应的探针[24,25]、激活过程[26,27]、光诱导电子转移（PET）[28]、分子内电荷转移（ICT）[29]、共轭系统的破坏与恢复[30]、巯基氧化[31]和肟（C=N-OH）氧化[32]。尽管有许多可用于检测HClO/ClO-的荧光探针，但它们通常存在合成工艺复杂、反应时间较长、生物相容性差和荧光强度低的问题[33]。这些限制阻碍了这些探针的实际应用。因此，开发具有优异物理性质、高选择性和良好稳定性的荧光探针对于HClO/ClO-的实时监测具有理论和实际意义。
本研究成功构建了一种新型荧光探针CMA-ClO，其具有“开启型”响应机制（图1）[34,35]。该探针含有硼酸基团（B-O结构）或富电子芳香胺（N结构），可作为HClO/ClO-的特异性识别位点。引入香豆素（CMA）使其具备靶向能力。荧光探针的合成涉及缩合和偶联反应。光物理实验验证了CMA-ClO的优秀选择性。此外，CMA-ClO还具有易于合成、高特异性和灵敏度、快速反应性和生物相容性等优点。在成像研究中，CMA-ClO能够有效响应HT-29和CT-26细胞中的HClO/ClO-水平。活细胞成像进一步证明了其在评估与HClO/ClO-相关的生物功能方面的潜力。
材料与表征
溶剂和通用实验室试剂购自Innochem Technology Co., Ltd。所有用于探针合成的化学物质和中间体由Adamas提供。1H NMR和13C NMR谱是在Bruker 400 MHz光谱仪上使用标准NMR管获得的。高分辨率质谱（HRMS）数据通过电喷雾离子化（ESI）在Thermo Acquity SQD仪器上收集。元素分析使用Exeter Analytical CE440元素分析仪进行。
CMA-ClO对HClO/ClO-的光谱响应
目标探针CMA-ClO由含有二乙氨基和硼酸酯基团的香豆素核心组成，形成了一种季铵溴盐，具有相对较高的水溶性。CMA-ClO在HClO/ClO-作用下的荧光发射光谱在不同比例的溶剂混合物中记录下来。如图S5（补充信息）所示，最大荧光强度出现在DMSO/PBS混合物中，体积比为5:5。
结论
本研究基于香豆素骨架构建并合成了一种创新的有机荧光探针CMA-ClO。光物理表征表明，CMA-ClO在DMSO/PBS缓冲液（1:1，体积比，pH 7.4）中对HClO/ClO-具有高选择性和低检测限。通过滴定NMR和高分辨率质谱（HRMS）验证了其识别机制。此外，该探针具有良好的生物相容性，并已成功应用于...
CRediT作者贡献声明
张浩：撰写——初稿。何坤：方法学。栾明清：实验研究。张洪硕：方法学。张明伟：形式分析。葛超超：软件。李秀芳：方法学。丁格：撰写——审阅与编辑，实验研究。司万彤：监督，方法学。王新超：撰写——审阅与编辑。
利益冲突声明
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致谢
我们感谢山东省自然科学基金支持的ZR2020QB180和ZR2022MB037项目的资金支持。何坤感谢山东省大学生创新创业培训计划（项目编号：S202510455014）的资助。丁格非常感谢重庆艺术与科学大学的支持（项目编号：P2021HH01），司万彤非常感谢重庆市教委的支持。
