Asprosin（ASP）通过促进PINK1介导的线粒体自噬抑制缺氧/复氧诱导的H9C2细胞铁死亡

《Cardiovascular Therapeutics》：Asprosin Protects H9C2 Cells From Ferroptosis Following Hypoxia/Reoxygenation by Promoting Mitophagy

本文聚焦心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）的治疗靶点探索。研究发现，脂肪因子Asprosin（ASP）可显著改善缺氧/复氧（H/R）诱导的H9C2心肌细胞损伤，其保护机制在于通过激活PINK1/Parkin通路促进线粒体自噬（mitophagy），进而抑制细胞铁死亡（ferroptosis）——具体表现为上调谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）表达，提升谷胱甘肽（GSH）水平，并降低细胞内活性氧（ROS）和铁离子（Fe2+）积累。该研究揭示了ASP调控心肌细胞命运的新途径，为MIRI的临床干预提供了潜在策略。

　　

1. 引言

急性心肌梗死（AMI）是全球主要的死亡原因，经皮冠状动脉介入治疗是恢复心肌血流的主要方法，但再灌注过程本身可能导致心肌损伤，即心肌缺血/再灌注损伤（MIRI），严重影响患者预后。缺氧/复氧（H/R）会触发一系列有害事件，包括活性氧（ROS）过量产生、铁死亡（ferroptosis）、钙超载、炎症、细胞凋亡和线粒体功能障碍，最终导致心肌细胞死亡。

Asprosin（ASP）是一种于2016年新发现的脂肪因子，由原纤维蛋白1（FBN1）基因编码，在包括心脏在内的多种器官中表达。已有研究表明，ASP能够增强间充质基质细胞对缺血性心脏病的治疗效果，减少心肌细胞中的ROS，并改善左心室功能。此外，ASP还能诱导脂肪细胞线粒体自噬。然而，ASP是否参与心肌细胞中的铁死亡和线粒体自噬过程尚不清楚。

铁死亡在MIRI中扮演重要角色，其特征包括脂质过氧化产物积累、细胞内铁积累、谷胱甘肽（GSH）耗竭以及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性降低，主要通过SLC7A11/GPX4通路进行调控。抑制铁死亡有助于减轻MIRI。

线粒体自噬（mitophagy）是指受损或多余的线粒体通过自噬-溶酶体途径被选择性清除的过程。PTEN诱导的激酶1（PINK1）密切参与其调控。在应激条件下，PINK1转移至线粒体外膜，募集Parkin，并将受损线粒体靶向至溶酶体降解。适度的线粒体自噬是一种保护机制，但ASP能否通过影响线粒体自噬来保护缺血/再灌注后的心肌细胞仍不明确。

本研究旨在探讨ASP预处理对H/R诱导的H9C2心肌细胞死亡的影响，并深入分析ASP是否通过促进线粒体自噬来抑制铁死亡，从而发挥心肌保护作用。

2. 方法

2.1. 数据来源

从基因表达综合数据库（GEO）下载数据集GSE240847，包含21个大鼠样本的表达数据。从FerrDb数据库收集了511个铁死亡相关基因。

2.2. 功能与通路富集分析及WGCNA

利用“Sangerbox”在线工具对GSE240847进行加权基因共表达网络分析（WGCNA），以识别与FBN1相关的共表达模块，并对该模块进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。

2.3. 细胞培养与H/R模型

使用大鼠胚胎心肌细胞系H9C2。建立H/R模型：将细胞置于缺氧条件（1% O₂, 5% CO₂, 94% N₂）下6小时，然后更换培养基并在复氧条件（95%空气，5% CO₂）下培养12小时。实验组在H/R前用不同浓度（50, 100, 150 nM）的ASP预处理12小时。在部分实验中，同时使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1, 5 μM）或线粒体自噬抑制剂线粒体分裂抑制剂1（Mdivi-1, 50 μM）。

2.4. 检测指标

通过相应试剂盒检测细胞内ROS水平、细胞活力（CCK-8法）、乳酸脱氢酶（LDH）释放、线粒体膜电位（JC-1染色）、GSH含量和细胞内Fe²⁺水平。通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11，以及线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、P62的表达。

3. 结果

3.1. WGCNA与富集分析

WGCNA分析获得了11个共表达模块。对FBN1所在的共表达模块（包含2161个基因）进行富集分析。GO分析显示，该模块在生物过程（BP）上显著富集于GTPase活性调节等信号转导过程；在细胞组分（CC）上富集于染色体区域等；在分子功能（MF）上富集于DNA解旋酶活性等。KEGG分析则显示该模块显著富集于线粒体自噬和MAPK信号通路。该模块与铁死亡相关基因集存在67个交集基因。

3.2. ASP对H/R诱导的H9C2细胞损伤的保护作用

ASP预处理能剂量依赖性地抑制H/R诱导的H9C2细胞内ROS升高。同时，ASP剂量依赖性地提高了H/R后细胞的活力（CCK-8结果）并降低了LDH释放导致的细胞死亡。

3.3. ASP保护H9C2细胞免受H/R诱导的铁死亡

ASP（50, 100, 150 nM）能剂量依赖性地缓解H/R诱导的GPX4和SLC7A11蛋白表达下降，并抑制GSH水平的降低。此外，ASP还剂量依赖性地减少了H/R引起的细胞内Fe²⁺含量增加。使用铁死亡抑制剂Fer-1作为阳性对照的实验进一步证实，ASP具有与Fer-1相似的抑制铁死亡的效果。

3.4. ASP促进H/R损伤后H9C2细胞的线粒体自噬

研究发现，ASP能剂量依赖性地抑制H/R诱导的P62蛋白表达，并增强PINK1和Parkin蛋白的表达。JC-1染色结果显示，随着ASP预处理浓度的增加，H/R后H9C2细胞中增强的绿色荧光（指示线粒体膜电位降低）被减弱，表明ASP有助于稳定线粒体膜电位。

3.5. 抑制线粒体自噬可消除ASP对细胞活力下降和铁死亡的保护作用

为验证线粒体自噬在ASP保护作用中的必要性，研究使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1与ASP共处理H9C2细胞。结果发现，Mdivi-1逆转了ASP对PINK1和Parkin蛋白的上调作用，并增强了P62蛋白表达，同时加重了线粒体膜电位的下降。更重要的是，Mdivi-1处理废除了ASP对H/R诱导的细胞活力下降的保护作用，并逆转了ASP对ROS生成的抑制。此外，Mdivi-1也抵消了ASP对铁死亡的抑制作用，表现为GSH水平、GPX4和SLC7A11蛋白表达的下降，以及细胞内Fe²⁺水平的回升。这些结果表明，ASP正是通过促进线粒体自噬来抑制铁死亡，进而保护H9C2细胞免受H/R损伤。

4. 讨论

本研究在H9C2细胞的H/R模型中应用ASP和线粒体自噬抑制剂Mdivi-1，观察了线粒体自噬和铁死亡指标的变化。提供了多方面证据表明ASP对H/R损伤的心肌细胞具有保护作用。生物信息学分析提示FBN1（编码ASP）相关的基因模块与线粒体自噬和铁死亡通路存在关联。体外实验证实，ASP能剂量依赖性地提高细胞活力，减少ROS和LDH释放。在机制上，ASP通过上调SLC7A11/GPX4轴、增加GSH、减少铁积累来抑制铁死亡；同时，ASP通过PINK1/Parkin通路促进线粒体自噬，稳定线粒体膜电位。最关键的是，当使用Mdivi-1抑制线粒体自噬后，ASP对细胞活力的保护作用及其对铁死亡的抑制作用均被取消。这清晰地证明，ASP是通过促进PINK1介导的线粒体自噬来抑制心肌细胞在H/R条件下的铁死亡。

综上所述，本研究首次揭示了脂肪因子ASP在心肌缺血/再灌注损伤中的新功能：通过激活PINK1/Parkin通路增强线粒体自噬，进而遏制铁死亡程序，最终实现心肌保护。这为理解MIRI的复杂机制提供了新视角，并将ASP确立为一个潜在的治疗靶点，为开发针对心肌缺血/再灌注损伤的新型保护策略奠定了理论基础。