《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Detection and quantification of ezetimibe and its major glucuronide in patients with hepatic impairment via liquid chromatography-tandem mass spectrometry
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Ezetimibe及其代谢物EZEG在肝损伤患者血浆和尿液中的LC-MS/MS检测方法开发与验证。优化负离子模式分离条件，甲醇蛋白沉淀提取，满足FDA/EMA标准，支持临床药代评估和EZEG作为肝功能生物标志物研究。
多米尼克·O·法雷拉（Dominique O. Farrera）| 马克斯·M·马洛尼（Max M. Maloney）| 克里斯托弗·S·拉马德里（Christopher S. LaMadrid）| 佩奇·伦岑-哈默尔（Paige Lenzen-Hammerel）| 劳伦·R·拉德特克（Lauren R. Radtke）| 内森·J·切林顿（Nathan J. Cherrington）
美国亚利桑那大学药学院药理学与毒理学系，图森，AZ 85721
摘要
在给予依折麦布（EZE）后，肝功能受损患者的葡萄糖醛酸化代谢物依折麦布-葡萄糖醛酸苷（EZEG）的水平会发生变化。本研究开发并验证了一种快速、灵敏的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于定量人体血浆和尿液中的EZE和EZEG。样品通过含有稳定同位素标记内标（EZE-d4和EZEG-d4）的甲醇进行制备。分析物的分离采用乙腈-水（0.1%甲酸）作为流动相，在C18柱上以0.5 mL/min的流速进行。分析物通过负离子化多反应监测（MRM）模式进行检测。m/z 408.4→271.0和m/z 584.5→271.0的质量转换对分别用于定量EZE和EZEG。该方法在血浆中EZE和EZEG的浓度范围为1.5 ng/mL至1 μg/mL时呈线性关系；在尿液中，EZE的检测范围为5 ng/mL至1 μg/mL，EZEG的范围为3 ng/mL至1 μg/mL。该方法根据美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的监管标准进行了验证，包括特异性、灵敏度、稳定性、重复性和再现性方面的评估，从而确保了测试结果的准确性和可靠性，进而提高了患者安全性并有助于临床决策。
引言
肝功能受损是一个重要的临床问题，因为它显著影响药物的分布、代谢和清除，最终影响安全性和治疗效果[1]。当肝脏代谢或胆汁排泄是药物清除的主要途径时，监管机构（如美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）建议对肝功能受损患者的药代动力学进行正式评估[2]。虽然肝生化检测和临床评分系统（如Child-Pugh分类）仍是分层评估肝功能受损的标准方法，但这些方法在确定药物处理能力方面缺乏精确性[3][4]。因此，需要能够直接且定量反映肝功能的外源性探针。
依折麦布（EZE）是一种经FDA批准用于治疗高脂血症的药物。口服后，EZE在肝脏和肠道中经历广泛的葡萄糖醛酸化，形成其主要循环代谢物依折麦布-葡萄糖醛酸苷（EZEG）[5]。在健康个体中，EZEG主要通过胆汁排泄清除[5]。然而，在肝功能受损的患者中，肝胆转运能力下降和清除减少导致EZEG的全身分布发生变化，表现为血浆浓度升高和尿液中EZEG的回收量增加[6][7][8][9]。
这些药代动力学变化表明，EZE和EZEG的分布可能作为一种机制上合理的、潜在符合监管要求的外源性肝功能生物标志物。目前有多种方法可用于检测人体血浆中的EZE和EZEG[10][11][12][13][14]。然而，目前尚无完全验证的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法可用于定量尿液中的EZEG，而尿液样本在肝功能受损研究中可能具有特别重要的信息价值。此外，尽管已经探索了一步蛋白质沉淀协议用于生物分析工作流程，但现有方法通常依赖于多步骤提取程序，或者缺乏准确测量极性葡萄糖醛酸化代谢物（如EZEG）所需的灵敏度和稳健性[15]。为解决这些问题，我们开发并验证了一种快速、灵敏且特异的LC-MS/MS方法，用于同时定量血浆和尿液中的EZE和EZEG。通过优化的单步蛋白质沉淀方法，该方法实现了低定量限、良好的回收率以及优异的稳定性，同时满足FDA和EMA的监管要求。因此，该方法为评估肝功能受损患者的EZE药代动力学提供了一个新颖可靠的分析平台，并有助于探索EZEG作为临床有用的肝功能外源性生物标志物的潜力。
化学品
除非另有说明，所有化学品均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。EZE和ezetimibe-d4（EZE-d4）购自Cayman Chemicals（美国密歇根州安娜堡）。EZEG购自Sussex Research（加拿大渥太华）。Ezetimibe-D-葡萄糖醛酸苷-d4（EZEG-d4）购自Biosynth International（美国肯塔基州路易斯维尔）。HPLC级甲醇、乙腈（ACN）、甲酸和水均购自Thermo Fisher Scientific（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）。
LC-MS/MS方法优化
由于EZEG含有羧基，该方法最初在负离子模式下进行优化。也对EZE进行了正离子模式的评估，但负离子模式获得了更高的峰强度。优先同时检测EZE及其葡萄糖醛酸化代谢物的决定是基于EZEG作为主要循环代谢物的相关性及其作为反映肝胆代谢和转运功能的生物标志物的潜在应用。
结论
开发并验证了一种快速、灵敏且特异的LC-MS/MS方法，用于同时定量人体血浆和尿液中的EZE及其葡萄糖醛酸化代谢物EZEG。在含有0.1%甲酸的ACN-水流动相下，采用分段梯度进行优化，实现了高效的色谱分离和可重复的峰形。使用甲醇进行蛋白质沉淀可有效提取样品，同时具有稳定的回收率和最小的基质效应。
作者贡献声明
克里斯托弗·S·拉马德里（Christopher S. LaMadrid）： 数据管理。佩奇·伦岑-哈默尔（Paige Lenzen-Hammerel）： 数据管理。多米尼克·O·法雷拉（Dominique O. Farrera）： 写作——审阅与编辑、撰写初稿、验证、监督、项目管理、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。马克斯·M·马洛尼（Max M. Maloney）： 数据管理。劳伦·R·拉德特克（Lauren R. Radtke）： 数据管理。内森·J·切林顿（Nathan J. Cherrington）： 写作——审阅与编辑、监督、资源获取、资金筹集、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
