《Clinical and Translational Medicine》：Macrophage-derived galectin-3 contributes to pyroptosis, apoptosis and necroptosis through TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 during atherosclerosis
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这篇综述揭示了巨噬细胞程序性死亡的新机制。研究发现，在动脉粥样硬化（AS）中，巨噬细胞可同时发生焦亡（pyroptosis）、凋亡（apoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis），这三种死亡形式被统称为“PANoptosis”。研究通过多组学分析将半乳糖凝集素-3（Galectin-3, Lgals3）鉴定为关键调控因子。Galectin-3在AS斑块内巨噬细胞中高表达，通过与NLRP3炎性小体相互作用，激活TLR4/MyD88/NF-κB信号轴，进而诱导上述三种细胞死亡协同发生。遗传学缺失或敲低Galectin-3可显著减轻AS病变，而激活NLRP3则加重疾病。该研究为AS的治疗提供了新的潜在干预靶点。
1 引言
动脉粥样硬化是一种以脂质沉积和慢性炎症为特征的血管疾病。巨噬细胞是动脉粥样硬化斑块中的主要细胞成分，在斑块形成和进展中扮演核心角色。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）可诱导巨噬细胞泡沫细胞死亡，释放促炎因子，加速疾病进程。程序性细胞死亡，包括坏死性凋亡、焦亡和凋亡，是AS病理过程中的重要事件。坏死性凋亡是一种裂解性细胞死亡，形态类似坏死，涉及受体相互作用蛋白激酶1/3（RIPK1/3）和磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白（pMLKL）的激活。焦亡是一种炎症性细胞死亡，由NLRP3炎性小体激活半胱天冬酶-1（caspase-1）后切割消皮素D（GSDMD）触发，形成细胞膜孔道。凋亡则由caspase级联反应（如caspase-3, caspase-8）激活。越来越多的证据表明，在感染性疾病、自身免疫病和恶性肿瘤中，坏死性凋亡、焦亡和凋亡可同时发生并存在广泛串扰，形成了“PANoptosis”的概念。本研究旨在探究在晚期动脉粥样硬化中，巨噬细胞的这三种死亡形式是否协同发生，并探索其调控机制。
研究者整合了来自基因表达综合数据库（GEO）的GSE83112数据集，对小鼠动脉粥样硬化主动脉进行了差异表达基因（DEGs）分析。同时，对高脂饮食（HFD）喂养的ApoE-/-小鼠主动脉进行了蛋白质组学分析，鉴定出差异表达蛋白（DEPs）。比较两组数据，发现了三个在动脉粥样硬化主动脉中共同上调的分子：Lgals3（Galectin-3）、Vcam1和Ctss。在人类颈动脉内膜切除术斑块的mRNA测序数据集（GSE111782）中，这三个分子在PANoptosis标志物高表达的斑块中同样显著上调。此外，对颈动脉内膜切除术标本的单细胞转录组数据（GSE159677）分析显示，Galectin-3阳性的巨噬细胞在人类颈动脉斑块的动脉粥样硬化核心区域富集。
Galectin-3是一种参与多种生物活动的凝集素。其在动脉粥样硬化中的作用存在争议，有研究显示其缺失可减轻斑块，也有研究称其具有保护作用。NLRP3炎性小体在巨噬细胞中被ox-LDL激活，促进动脉粥样硬化发生，并且是组装PANoptosome复合体和启动三种死亡形式的关键。Galectin-3可与NLRP3相互作用调控巨噬细胞炎症级联反应。对巨噬细胞亚群的基因集富集分析（GSEA）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，巨噬细胞的程序性细胞死亡可能与髓样分化初级反应蛋白88（MyD88）依赖的Toll样受体4（TLR4）和核因子κB（NF-κB）信号通路有关。因此，本研究进一步探究TLR4/MyD88/NF-κB轴是否在Galectin-3/NLRP3的共同调控下参与巨噬细胞的三种死亡过程。
2 结果
3.1/3.2 蛋白质组学与转录组学鉴定小鼠动脉粥样硬化主动脉的DEPs和DEGs
对HFD喂养的ApoE-/-小鼠主动脉进行蛋白质组学分析，发现212个DEPs，其中104个上调，108个下调。KEGG分析显示，这些DEPs显著富集于细胞凋亡、TNF信号通路等通路。基因集富集分析（GSEA）也提示粘附、白细胞跨内皮迁移、Toll样受体信号通路和凋亡相关基因集上调。转录组学分析（GSE83112数据集）鉴定出314个DEGs（225个上调，89个下调），KEGG分析同样显示细胞凋亡是主要富集的死亡形式。将DEPs与DEGs取交集，得到三个共同上调的分子：Lgals3（Galectin-3）、Vcam1和Ctss。
3.3 基于PANoptosis相关基因的人类颈动脉数据库聚类分析
利用GSE111782人类颈动脉内膜切除术标本数据集，根据11个PANoptosis相关基因（ZBP1, RIPK1, RIPK3, FADD, CASP8, NLRP3, ASC, CASP1, GSDMD, MLKL, NINJ1）的表达进行一致性聚类分析，将样本分为两个簇（Cluster 1和Cluster 2）。Cluster 1具有更高的免疫、基质和总体ESTIMATE评分，巨噬细胞M1和M2浸润更丰富，被视为基质/免疫“热”斑块。Cluster 1中RIPK3、CASP1、ASC和NLRP3等PANoptosis基因表达显著高于Cluster 2。同时，Lgals3、Vcam1和Ctss这三个分子在Cluster 1中也显著高表达。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析表明，这三个分子与PANoptosis相关基因存在相互作用。
3.4 Galectin-3在人和小鼠动脉粥样硬化病变中表达升高
对颈动脉内膜切除术组织的单细胞转录组数据分析显示，巨噬细胞在动脉粥样硬化核心（AC）区域的比例远高于邻近动脉（PA）区域。Galectin-3阳性细胞在AC的巨噬细胞中比例显著增加。在巨噬细胞亚型中，具有炎症/组织驻留样特征的My.1和Trem2表达的泡沫样My.2亚型是Galectin-3阳性的主要群体。蛋白印迹和免疫荧光染色证实，Galectin-3在人和小鼠的动脉粥样硬化病变中表达上调，且与NLRP3共定位于巨噬细胞（人CD68+，小鼠F4/80+）中。免疫共沉淀实验进一步证实了Galectin-3与NLRP3之间存在直接的相互作用。
3.5 PANoptosis与TLR4/MyD88/NF-κB通路潜在相关
对巨噬细胞中差异表达基因的分析显示，Lgals3是关键的DEG之一。GO生物过程和KEGG通路富集分析表明，巨噬细胞中与坏死性凋亡、焦亡、凋亡相关的生物学过程，以及MyD88依赖的TLR4信号通路和经典NF-κB信号转导通路显著富集。GSEA结果进一步确认，与坏死性凋亡、焦亡、凋亡、NF-κB和Toll样受体信号通路相关的基因集在动脉粥样硬化巨噬细胞中上调。
3.6 PANoptosis样细胞死亡在人类动脉粥样硬化病变中被激活
对人和小鼠晚期动脉粥样硬化病变的组织学分析显示存在坏死核心、脂质沉积和纤维化。透射电镜观察到了具有焦亡（细胞肿胀、膜孔形成）、凋亡（染色质浓缩、细胞体积减少）和坏死性凋亡（细胞器肿大、质膜破裂）超微结构特征的巨噬细胞。蛋白印迹分析显示，人动脉粥样硬化斑块中NLRP3、切割的GSDMD-N、切割的caspase-3、切割的caspase-8、RIPK3和pMLKL的表达均显著上调，caspase-3活性增强。同时，TLR4、MyD88和pNF-κB的表达也升高，促炎细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-18）释放增加。免疫荧光染色显示，GSDMD、caspase-3和RIPK3在斑块内共定位，且三者均与巨噬细胞标志物CD68共定位，表明三种死亡形式共存于斑块内的巨噬细胞中。
3.7/3.8 ox-LDL通过Galectin-3/TLR4/MyD88/NF-κB轴诱导巨噬细胞发生PANoptosis
在体外，ox-LDL处理的巨噬细胞也表现出三种死亡形式的超微结构特征，且caspase-3与RIPK3或GSDMD共定位。ox-LDL可上调巨噬细胞中Galectin-3的表达。利用小干扰RNA（siRNA）敲低Galectin-3后，ox-LDL诱导的细胞凋亡（Annexin V/PI阳性比例）、焦亡/坏死（PI摄取、LDH释放）以及泡沫细胞形成均得到显著缓解。同时，敲低Galectin-3可抑制ox-LDL引起的NLRP3/GSDMD-N上调、caspase-3/caspase-8切割、RIPK3/pMLKL上调、促炎因子释放以及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活。NF-κB的核转位也被抑制。联合使用细胞死亡抑制剂（凋亡抑制剂Z-VAD、焦亡抑制剂双硫仑DSF、坏死性凋亡抑制剂Nec-1）的实验表明，三者联用对ox-LDL诱导的细胞死亡保护作用最强，提示死亡是协同发生的。
为了探究Galectin-3的下游机制，研究使用了NLRP3激动剂尼日利亚菌素（nigericin）。免疫荧光和免疫共沉淀证实Galectin-3与NLRP3相互作用。在ox-LDL处理的巨噬细胞中，敲低Galectin-3对细胞死亡、相关蛋白表达及炎症因子释放的抑制作用，可被nigerici部分逆转。同样，使用Galectin-3抑制剂TD139也能减轻ox-LDL诱导的三种死亡相关蛋白的表达。这些结果表明，Galectin-3至少部分通过激活NLRP3来启动巨噬细胞的PANoptosis。
3.9 Galectin-3缺失减轻而NLRP3激动剂加重小鼠动脉粥样硬化中的PANoptosis
在体实验中，HFD喂养的ApoE-/-小鼠主动脉中同样观察到了三种死亡形式的超微结构证据，且GSDMD、caspase-3、RIPK3共定位于巨噬细胞。与ApoE-/-对照组相比，HFD喂养的ApoE-/-小鼠主动脉中NLRP3、GSDMD-N、切割的caspase-3/8、RIPK3、pMLKL、TLR4、MyD88、pNF-κB的表达及caspase-3活性均显著升高。在HFD喂养的同时给予NLRR3激动剂nigerici，会进一步加剧上述蛋白（除TLR4/MyD88/pNF-κB外）的上调和caspase-3活性。相反，在Galectin-3-/-/ApoE-/-双敲除小鼠中，HFD诱导的上述所有变化（包括TLR4/MyD88/pNF-κB信号）均得到显著缓解。这表明，Galectin-3缺失通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3轴减轻PANoptosis和动脉粥样硬化，而激活NLRP3则会加重疾病，但不影响上游的TLR4/MyD88/NF-κB通路。
3.10 巨噬细胞特异性敲低TLR4通过抑制下游通路减轻动脉粥样硬化
为明确TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3轴的作用，研究者构建了巨噬细胞特异性敲低TLR4的腺相关病毒（AAV-F4/80-shTLR4），通过尾静脉注射给ApoE-/-小鼠。结果显示，敲低TLR4可有效降低主动脉中TLR4的mRNA和蛋白水平，并下调其下游分子MyD88、pNF-κB和NLRP3的表达。与注射空载体对照病毒的小鼠相比，注射AAV-F4/80-shTLR4的小鼠，其全身主动脉和主动脉窦的斑块面积、坏死核心面积均显著减小，纤维帽厚度增加。这直接证明了靶向巨噬细胞TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号轴可以抑制动脉粥样硬化的进展。
4 结论
本研究首次系统证实，在动脉粥样硬化中，巨噬细胞的焦亡、凋亡和坏死性凋亡可协同发生（PANoptosis）。Galectin-3被鉴定为调控这一过程的关键分子。它在动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞中高表达，通过与NLRP3相互作用，激活TLR4/MyD88/NF-κB信号轴，进而协同诱导上述三种程序性细胞死亡，促进血管炎症和动脉粥样硬化斑块的发展。遗传学上缺失或敲低Galectin-3，或巨噬细胞特异性敲低TLR4，均可通过抑制该信号轴减轻疾病；而激活NLRP3则产生相反效果。该研究揭示了动脉粥样硬化中巨噬细胞死亡调控的新机制，并将Galectin-3/TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3轴确立为干预动脉粥样硬化的潜在新靶点。
