《LWT》：Caldibacillus thermoamylovorans, the thermophilic bacterium separated from raw milk, would be the crucial spoiler of dairy products
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为应对耐热芽孢杆菌导致的UHT灭菌乳腐败问题，研究人员从生乳中分离鉴定了嗜热耐热菌C. thermoamylovorans，系统评估了其生物膜形成、孢子萌发、热抗性及在乳中的腐败潜力。研究发现，该菌具有极强的热抗性，可显著破坏UHT乳的胶体稳定性、加速pH降低、产生异味并缩短货架期。此项研究强调了其在乳业中的重大风险，为开发精准检测和有效灭菌策略提供了关键依据。
牛奶，素有“白色血液”之称，其丰富的营养成分却也使其成为微生物滋生的“温床”，极易腐败变质。在乳制品工业中，超高温瞬时灭菌（UHT）技术被广泛应用，它能在短时间内以高温（通常135-150°C，数秒）杀灭绝大多数微生物，使得产品能在常温下长期保存。在中国，UHT乳占据了液态奶市场的绝大部分份额。然而，即便是如此“严酷”的灭菌过程，也并非无懈可击。有一类顽强的微生物——嗜热细菌，特别是那些能够形成高度耐热内生孢子的细菌，能够幸存下来。这些“漏网之鱼”就像潜伏在乳制品中的“定时炸弹”，在后续的储存、运输过程中，一旦条件适宜（如温度升高），便会苏醒、繁殖，并分泌各种水解酶（如蛋白酶、脂酶），持续分解乳中的蛋白质和脂肪，导致产品出现絮凝、分层、pH下降、产生酸败味等腐败现象，造成巨大的经济损失和食品安全隐患。
长期以来，芽孢杆菌科（Bacillaceae）的成员被认为是生乳和乳制品中最主要的嗜热污染菌。然而，随着检测技术的进步，一种名为Caldibacillus thermoamylovorans（嗜热耐热芽孢杆菌）的细菌逐渐进入研究者的视野。它最初在棕榈酒中被发现，随后在发酵食品、污泥生物干化系统等多种高温或富营养环境中被检测到。尽管已有零星报告在乳场环境和变质乳制品中检出该菌，但关于其生理特性、耐热机制及其在乳系统中具体腐败潜力的系统性研究却非常缺乏。它究竟有多耐热？在乳中会造成多严重的破坏？这些问题亟待解答。为此，一支来自中国农业科学院的研究团队展开了深入调查，相关成果发表在国际食品期刊《LWT》上。
为了揭示C. thermoamylovorans对乳业的威胁，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，从中国河北采集的生乳样品中分离纯化出两株耐热菌株（S1和M1）。接着，通过16S rRNA和rpoB基因测序结合系统发育分析对菌株进行了精准分子鉴定。为评估其耐热性，研究建立了创新的PMA-qPCR（叠氮溴化丙锭-定量聚合酶链式反应）方法，用于定量热处理后的活菌孢子。此外，还系统检测了菌株的生物膜形成能力、孢子产量、蛋白酶及脂酶活性。最后，通过人工污染UHT乳模型，结合电子舌、电子鼻、Zeta电位及Turbiscan稳定性分析仪（TSI）等多种现代分析手段，全面评估了该菌污染对乳品理化性质、风味和稳定性的影响。
3.1. 生乳中嗜热细菌的形态学测定
研究人员从生乳中分离出两株耐热菌株M1和S1。在培养基上，它们形成灰白色、表面粗糙的蜡滴状菌落。显微镜下观察显示，细胞呈革兰氏阳性，长杆状或丝状，末端钝圆。在含脱氧胆酸盐琼脂（DTA）的平板上，菌落周围出现明显的黄色变色圈，暗示其能产生丰富的水解酶。
3.2. 利用16s和rpoB基因对嗜热细菌进行鉴定
通过16S rDNA和rpoB基因片段扩增、测序及BLAST（基本局部比对搜索工具）比对，证实两株菌的序列与C. thermoamylovorans的参考序列匹配度最高。系统发育树分析进一步确认，两株分离株与C. thermoamylovorans亲缘关系最近，因此被鉴定为C. thermoamylovorans S1和C. thermoamylovorans M1。由于M1菌株显示更高的产水解酶能力，后续研究以其为对象展开。
3.3. C. thermoamylovorans的生长和发育特征
研究发现，C. thermoamylovorans在50°C下的生长优于25°C，表现出明显的温度依赖性生长模式。在乳中增殖实验也证实，较高温度（50°C）能显著促进其在乳中的生长。此外，该菌在50°C下产生的蛋白酶和脂酶活性也高于25°C。生物膜形成测定显示，其在50°C下形成生物膜的能力更强。更重要的是，与常见的污染菌Bacillus licheniformis（地衣芽孢杆菌）相比，C. thermoamylovorans能产生数量级高得多的耐热孢子，这为其在热处理中存活提供了关键优势。
3.4. 乳品加工中C. thermoamylovorans的耐热性
研究模拟了乳品加工中常见的四种热处理：低温长时间巴氏杀菌（LTLT，63°C 30分钟）、高温短时巴氏杀菌（HTST，70°C 30秒）、100°C 10分钟以及UHT处理（135°C 5秒）。传统平板计数显示，经LTLT和HTST处理后，细菌数量几乎无变化；100°C处理可显著减少活菌数；而UHT处理后仍有极少量菌落存活。创新的PMA-qPCR分析提供了更精确的活菌孢子定量结果：LTLT和HTST处理对C. thermoamylovorans几乎没有影响；100°C处理可灭活约90%的孢子；即使经过UHT处理，仍有约0.4 log CFU/mL（即每毫升几个）的活孢子残留。这证明了其对常规及超高温灭菌具有惊人的抵抗力。
3.5. C. thermoamylovorans污染对乳品质的影响
将C. thermoamylovorans人工接种到UHT乳中，分别在25°C（模拟常温储存）和50°C（模拟高温条件）下培养。结果显示，在50°C下储存的污染乳样出现了明显的絮凝、凝结和乳液分离，pH值从6.5显著下降至5.4；而在25°C下变化较小。电子鼻分析表明，50°C污染乳产生了令人不悦的气味。电子舌分析则提示，污染乳的咸味等感官属性发生了显著变化。稳定性分析表明，污染导致乳的Zeta电位绝对值降低，意味着胶体稳定性下降。Turbiscan稳定性指数（TSI）分析进一步证实，尤其在50°C下，乳液的失稳现象急剧加剧。
本研究得出结论，Caldibacillus thermoamylovorans是一种具有高度耐热性、强产孢能力的细菌，对乳制品质量和安全构成严重威胁。从中国北方生乳中分离的菌株表现出强大的生物膜形成能力、高效的孢子化能力和卓越的耐热性。它能够污染UHT乳，破坏其胶体稳定性，加速pH值下降，并导致异味产生和货架期缩短。这些发现突显了该菌在乳业链条中的显著风险。
在讨论中，研究者强调了该菌耐热性远超其他常见食品腐败菌，如Bacillus coagulans（凝结芽孢杆菌）和Geobacillus stearothermophilus（嗜热脂肪地芽孢杆菌）。其污染可能源于农场（如垫料），并通过生物膜在加工设备上持续存在，导致交叉污染。该菌分泌的热稳定淀粉酶和蛋白酶即使在无明显腐败迹象时也能引起潜在的酸化、异味和胶体失稳。为了应对这一挑战，仅靠传统热处理已不足够，需要整合高压加工、脉冲电场等先进技术，并加强针对生物膜的清洗规程和农场卫生管理。同时，开发基于qPCR和基因的生物传感技术用于早期监测也至关重要。未来需要进一步阐明C. thermoamylovorans孢子耐热和生物膜持留的分子机制，为设计有效、可持续的控制策略奠定基础，以保障乳制品的质量和安全。
