《HUMAN MUTATION》：ALOX5 Expression and Pathomics Features Reveal New Insights Into Lung Adenocarcinoma Prognosis: Model Construction and Functional Validation
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本研究聚焦花生四烯酸5-脂氧合酶（ALOX5）在肺腺癌（LUAD）中的预后价值，首次整合病理图像（H&E染色）与人工智能（AI）驱动的病理组学（pathomics）技术，构建梯度提升机（GBM）模型。模型通过7个关键病理特征预测ALOX5表达水平，生成病理组学评分（PS），成功验证高ALOX5/高PS与改善的总生存期（OS）显著相关，并深入揭示其与凋亡、炎症反应通路及巨噬细胞浸润的机制关联。体外实验进一步证实ALOX5敲低促进肿瘤细胞增殖与迁移。本工作为LUAD的无创预后评估提供了创新思路与可靠工具。
文章内容归纳总结
引言
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌（NSCLC）最常见的亚型之一。晚期LUAD患者预后通常较差，因此识别有效的高风险预后分层指标至关重要。传统预后指标在早期诊断和治疗中存在局限，促使研究者探索无创、有效的生物标志物。花生四烯酸5-脂氧合酶（ALOX5）是脂氧合酶家族成员，在多种肿瘤进展中扮演关键角色，但其在LUAD中的预后价值及评估方法仍需深入探索。目前ALOX5表达水平评估多依赖外周血细胞因子检测、定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、Western blot（WB）或免疫组织化学（IHC）等方法，这些方法存在成本高、样本获取难或技术依赖性强等不足。苏木精-伊红（H&E）染色在临床实践中应用广泛，结合人工智能（AI）驱动的病理组学（pathomics）分析方法，为定量病理诊断、分子表达分析和疾病预后评估提供了新途径。本研究旨在通过病理组学方法预测LUAD组织中ALOX5的表达水平，并结合生物信息学分析，探索影响病理组学分析结果的潜在分子机制。
材料与方法
研究数据来源于癌症基因组图谱（TCGA）数据库，包括病理图像、转录组数据及临床随访资料。经过严格筛选，最终纳入327例样本。通过生存分析和Cox回归（单变量及多变量）评估ALOX5的预后价值，并进行亚组分析和交互作用检验。利用OTSU算法和PyRadiomics软件包对LUAD患者的病理图像进行分割和特征提取，共提取1488个特征。通过最小冗余最大相关（mRMR）和递归特征消除（RFE）算法筛选出7个最佳病理特征。使用梯度提升机（GBM）算法构建病理组学模型，并通过受试者工作特征曲线下面积（AUC）、校准曲线、Hosmer-Lemeshow拟合优度检验和决策曲线分析（DCA）评估模型性能。模型输出的病理组学评分（PS）用于后续预后分析。通过CIBERSORTx评估免疫细胞浸润状态，基因集富集分析（GSEA）探索差异表达基因富集的通路，加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定与预后相关的炎症反应基因，并进行Gene Ontology（GO）和KEGG富集分析。细胞实验使用八种NSCLC细胞系（H1975、H23、A549、PC9、H1299、H2170、HCC827、H460）和人工支气管上皮细胞（HBE），通过慢病毒载体构建ALOX5稳定过表达和敲低细胞系，并利用WB、qRT-PCR、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验、克隆形成实验和细胞划痕实验验证ALOX5的基因功能。统计使用R软件（版本4.1.0）进行。
结果
患者特征
327例患者根据ALOX5表达截断值（3.527）分为高表达组（n = 181）和低表达组（n = 146）。两组在年龄（p = 0.105）和性别（p = 0.787）分布上无显著差异，但在病理分期（p = 0.002）上有显著差异。
高ALOX5表达是LUAD患者OS的重要保护因素
ALOX5在正常组织中的表达显著高于癌组织（p < 0.001）。生存分析显示，高ALOX5表达与更好的OS显著相关（p = 0.012），中位生存时间分别为53.3个月（高表达组）和41.0个月（低表达组）。单变量和多变量Cox回归分析均证实高ALOX5表达是OS的独立保护因素（多变量调整后HR = 0.575；95% CI, 0.384–0.861；p = 0.007）。亚组分析显示，在年龄≤65岁的患者中，高ALOX5表达与改善的OS相关（HR = 0.501；95% CI, 0.293–0.856；p = 0.011）。
病理特征筛选与模型构建评估
从提取的1488个特征中，最终筛选出7个关键特征用于建模。使用GBM算法构建的病理组学模型在训练集（n = 230）中AUC为0.786，在验证集（n = 97）中AUC为0.741，显示出良好的预测性能。校准曲线和Hosmer-Lemeshow检验表明模型预测概率与实际基因表达概率具有良好的一致性，DCA曲线证实了模型的临床实用性。
高PS显著有助于改善LUAD患者的OS
根据模型预测的PS，患者被分为高PS组（n = 197）和低PS组（n = 130）。生存分析显示，高PS组中位生存时间为51.03个月，显著优于低PS组的39.9个月（p = 0.003）。单变量和多变量Cox回归分析均证实高PS是OS的独立保护因素（多变量调整后HR = 0.612；95% CI, 0.411–0.91；p = 0.02）。此外，高ALOX5表达组表现出更高的PS值。
病理机制分析
免疫细胞浸润分析显示，高PS组中M0、M1和M2型巨噬细胞的丰度显著更高（p < 0.05）。GSEA分析表明，PS高、低组间的差异表达基因在MAPK信号通路、凋亡和炎症反应通路中显著富集。进一步分析发现，PS与凋亡相关基因（如PIK3R5、FAS、PIK3CG）的表达呈显著正相关（p < 0.001）。WGCNA鉴定出一个与预后密切相关的关键模块（棕色模块），包含63个枢纽基因。GO富集分析显示这些基因显著富集于细胞因子介导的信号通路，KEGG分析显示其富集于Toll样受体信号通路。
ALOX5增强细胞增殖和迁移
细胞实验证实，在多种肺癌细胞系中ALOX5表达存在差异。在ALOX5高表达的A549和PC9细胞中敲低ALOX5，或在ALOX5低表达的H1975和H23细胞中过表达ALOX5，成功验证了遗传操作的效力。功能实验表明，敲低ALOX5显著增强了PC9和A549细胞的增殖能力（CCK-8实验）、克隆形成能力和迁移能力（划痕实验）。相反，过表达ALOX5则显著抑制了H23和H1975细胞的增殖、克隆形成和迁移能力。这些结果在分子和细胞水平证实了ALOX5在抑制肺癌进展中的功能。
结论
ALOX5表达水平与LUAD患者的总生存期（OS）存在强关联。基于病理组学构建的模型能够有效预测ALOX5的表达水平，进而预测LUAD患者的预后。该模型具有强大的预测性能和临床适用性。机制上，高病理组学评分（PS）与改善的OS相关，这可能通过调节凋亡通路、炎症反应以及增加肿瘤微环境中的巨噬细胞浸润来实现。细胞功能实验进一步证实，ALOX5具有抑制肺癌细胞增殖和迁移的作用。本研究为LUAD的无创预后评估提供了新的见解和工具。
