《Environmental Microbiology Reports》：Diversity and Plant Growth-Promoting Potential of Duckweed-Associated Bacteria on Wolffia globosa Biomass Production and Nutritional Quality
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本文系统研究了泰国不同地区芜萍（Wolffia globosa，一种高营养价值的水生植物）伴生细菌（DAB）的多样性及其作为植物促生菌（PGPB）的应用潜力。通过从6个省份采集的芜萍样本中分离出108株细菌，并从中筛选出6株高效、无致病性报告的PGPB。研究发现，与芜萍共培养时，这些菌株可显著提升其生长速率，其中荧光假单胞菌（Pseudomonas toyotomiensis）W5-11效果最突出，使芜萍干重和叶绿素含量分别提高3.18倍和2.75倍。所有筛选出的PGPB均能产生吲哚-3-乙酸（IAA）、铁载体并溶解磷酸盐。相关性分析进一步揭示了IAA的产生与芜萍蛋白质积累的正相关关系。该工作为利用PGPB作为生物肥料，在可持续农业中高效、安全地生产芜萍这种“超级食物”提供了重要的理论依据和菌株资源。
芜萍伴生细菌的多样性及其促生作用研究
引言
芜萍（Wolffia）是浮萍科（Lemnoideae）中一种无根的微小开花植物，因其在高淀粉和蛋白质积累方面的卓越能力而被认为是一种营养价值极高的“超级食物”。其蛋白质和碳水化合物含量分别可高达干重的50.89%和31.33%，并富含必需脂肪酸、多酚、类黄酮和抗氧化剂。近年来，随着商业种植兴趣的增加，如何提高其产量和品质成为研究重点。浮萍作为水生植物，与其伴生细菌（DAB）之间存在着紧密的共生关系，这些细菌在养分循环、胁迫耐受和宿主代谢等方面发挥着关键作用，形成了一个完整的生态功能单元——“全生物”。其中，植物促生细菌（PGPB）通过固氮、解磷、产铁载体和合成植物激素等机制直接促进植物生长。尽管已有研究报道了一些浮萍相关的PGPB，但对于无根的芜萍而言，相关研究仍不充分，其培养技术也面临挑战。本研究旨在分离和评估来自泰国的芜萍伴生细菌的多样性，筛选能够有效促进芜萍生长并改善其生物量品质的PGPB，以推动其安全、高效的商业化生产。
材料与方法
细菌分离与鉴定
研究从泰国六个省份的六个采样点采集了芜萍样本，样本中通常混杂有其他浮萍属植物。通过清洗、匀浆和稀释涂布在R2A培养基上，最终获得了108株可培养细菌。通过16S rRNA基因测序，这些菌株被鉴定为属于4个门、41个属、66个种。多样性最高的地点是一个拥有四种浮萍共存的自然池塘。同时，本研究还纳入了8株已知的对紫萍（Spirodela polyrhiza）具有促生作用的PGPB菌株用于后续比较。
无菌芜萍的制备与共培养筛选
从泰国巴吞他尼府（Pathum Thani）的一处自然池塘获得芜萍（Wolffia globosa）品系DKU-25W，并通过次氯酸钠处理建立无菌培养。通过悬浮法共培养，评估了所有分离菌株（共116株）对芜萍生长的影响。通过图像分析软件测量第0天和第7天的浮萍表面积覆盖度，计算相对生长率（RGR）和对植物生长的影响（EPG）值，筛选出高促生且无已知致病性的菌株。
共培养方法优化与大规模培养
比较了悬浮培养法和附着培养法对芜萍生长促进的效果。随后，在悬浮培养体系下，对筛选出的菌株测试了不同初始细菌浓度（OD600= 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0）的促生效果，以确定最佳接种密度。最后，在300毫升规模下，使用最佳浓度进行了大规模共培养实验，培养7天后，分析了芜萍的干重、叶绿素含量、总淀粉和总蛋白质含量。
PGP性状测定
对筛选出的PGPB菌株测定了其经典促生性状，包括IAA产量、产铁载体能力、溶解磷酸盐和钾的能力。此外，还评估了与氮循环相关的代谢（如硝酸盐还原、反硝化）以及植物定殖相关因子（如运动性、胞外聚合物EPS产量）。
结果
细菌多样性与筛选
从芜萍样本中分离出的108株细菌，在分类上表现出高度多样性，以变形菌门（Pseudomonadota）为主，其中又以α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）最为常见。根瘤菌科是最常见的科。在共培养筛选中，大多数菌株（104株）表现出促生作用，其中12株菌的EPG值超过50%。但考虑到病原性风险，最终筛选出6株高效且安全的PGPB用于后续研究，分别是：弯曲希瓦氏菌（Shinella curvata）W12-8、马库斯副球菌（Paracoccus marcusii）W7-16、荧光假单胞菌（Pseudomonas toyotomiensis）W5-11、地下新鞘氨醇菌（Novosphingobium subterraneum）W5-13、玫瑰花形根瘤菌（Rhizobium rosettiformans）30-37和偏心不黏柄菌（Asticcacaulis excentricus）25-48。其中，W12-8的促生效果最强（EPG 77.75%）。
培养方法优化
研究发现，与附着培养法相比，悬浮培养法能更显著地促进芜萍生长。不同PGPB菌株达到最佳促生效果所需的初始细菌浓度不同，例如W5-11在OD600= 1.0时效果最佳，而W12-8则在OD600= 2.0时表现最优。
大规模共培养效果
大规模共培养结果表明，PGPB能显著提高芜萍的生物量和品质。其中，W5-11的效果最为突出，使芜萍干重和叶绿素含量分别提升了3.18倍和2.75倍，蛋白质含量也达到最高（10.91%干重）。其他菌株也显著增加了干重（1.76-2.20倍）和叶绿素含量（1.60-2.25倍）。值得注意的是，W7-16和W5-13虽然增加了生物量，但降低了蛋白质含量。只有30-37菌株显著增加了总淀粉含量。
PGP性状分析
所有6株筛选出的PGPB均能产生IAA、铁载体并溶解磷酸盐。IAA产量在4.45至109.03 μg/mL之间，以W5-11产量最高。大部分菌株还能溶解钾。在氮利用方面，所有菌株都能利用氨基酸作为有机氮源，但W7-16、W5-13和30-37不能利用铵盐和硝酸盐。所有菌株都能进行硝酸盐还原，但不能进行反硝化或固氮。在定殖因子方面，W5-11和30-37具有运动性，所有菌株都能产生EPS，其中W7-16产量最高。
相关性分析
尽管样本量有限，相关性分析仍揭示了PGP性状与芜萍生长参数之间的一些潜在联系。细菌IAA产量与芜萍蛋白质含量呈强正相关（r = 0.85）。干重与解钾、解磷及IAA产量呈正相关。而铁载体产量则与干重和叶绿素含量呈负相关。主成分分析也支持了这些趋势。
讨论
本研究证实了芜萍伴生细菌群落具有高度的分类多样性，且以α-变形菌纲为优势类群，这与之前的报道一致。环境因素（如水污染）和宿主植物多样性共同塑造了细菌群落的组成。尽管环境存在差异，但一些核心细菌类群（如根瘤菌科、从毛单胞菌科、鞘脂单胞菌科）在不同样本中保持稳定，表明芜萍具有选择性招募有益微生物的能力。
筛选出的高效PGPB菌株在霍格兰氏培养基中对芜萍的促生效果，可媲美芜萍在营养更丰富的SH培养基中的生长，这凸显了它们作为生物肥料替代化学肥料的潜力。有趣的是，从紫萍中分离出的高效PGPB对芜萍同样有效，表明促生作用可能更依赖于特定的生化机制（如激素信号、表面黏附），而非严格的宿主专一性。
在促生机制方面，所有筛选菌株都具备IAA生产、产铁载体和解磷等经典性状，但它们在氮代谢和定殖能力上存在差异。悬浮培养法比附着培养法更有效，可能因为无根的芜萍为细菌提供的附着表面有限。最佳细菌接种浓度因菌株而异，过高浓度可能导致竞争加剧或引发植物防御反应，反而抑制生长。
在大规模培养中，PGPB显著提高了芜萍的干重和叶绿素含量，但蛋白质含量的提升相对有限，这可能与基础培养基营养水平有关。IAA产量与蛋白质积累的正相关性提示，细菌来源的IAA可能通过激活植物体内的生长素信号通路，调控氮同化和蛋白质合成相关基因的表达，从而促进蛋白质积累。这一机制在拟南芥等模式植物中已有研究支持。
总而言之，本研究分离并鉴定了一批能有效促进芜萍生长和改善其营养品质的PGPB，特别是荧光假单胞菌W5-11表现卓越。这些发现为开发基于PGPB的生物肥料，实现芜萍的可持续、高产、优质栽培奠定了重要的理论和应用基础。
