《Environmental Microbiology Reports》：Interactions of Mucus Monosaccharides and the Epidermal Microbiome in Four Benthic Elasmobranchs
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本文聚焦于软骨鱼类（鲨、鳐、魟）表皮黏液的化学组成及其对表皮微生物群落的调控作用。研究首次量化了四种底栖软骨鱼类（鹰魟、杰克逊港鲨、澳洲扁鲨、白斑鳐）表皮黏液的单糖成分，并利用宏基因组学鉴定了其表皮微生物组中与碳水化合物代谢相关的功能基因。研究发现，软骨鱼类黏液具有物种特异性的单糖特征，主要为葡萄糖、半乳糖、葡萄糖胺和岩藻糖，且含量低于其他海洋生物。与水体微生物相比，宿主表皮微生物组具有更高的碳利用（如单糖、多糖代谢）基因丰度，并含有利用宿主黏液特异性单糖的基因通路。这表明软骨鱼类的表皮黏液并非仅是物理屏障，其化学组成是塑造和选择特定表皮微生物群落的关键调节因子，为理解宿主生理与共生微生物的相互作用提供了新见解。
引言：作为第一道防线的表皮黏液
皮肤和黏液是所有生物抵御物理磨损、感染和缓冲环境变化的第一道防线。与许多陆生生物不同，海洋生物如鱼类和软骨鱼类（Elasmobranchs，包括鲨、鳐、魟）的皮肤缺乏死亡的角质化保护层。由于其表皮完全由活细胞构成，黏液的保护作用至关重要。在海洋环境中，黏液持续与周围水体接触，不断受到化学物质、微生物和碎屑的冲击。
黏液由黏蛋白（Mucin）基因编码，这些基因存在于所有脊椎和无脊椎动物中，构成了黏液分子的骨架。在软骨鱼类中，黏蛋白同源物存在变异。黏液由位于上皮表面的杯状细胞分泌，而囊状细胞和棒状细胞分泌的额外分子与黏蛋白相互作用，形成一系列糖蛋白。糖蛋白是通过天冬酰胺（N-糖基化）或丝氨酸/苏氨酸（O-糖基化）与寡糖链共价连接的蛋白质。O-聚糖在脊椎动物中更为常见，由不同的单糖构型组成核心1至核心8结构，例如核心1由连接N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）的半乳糖构成。
黏液通过充当物理屏障提供机械保护，例如通过不断脱落清除附着的微生物和颗粒。同时，黏液含有蛋白酶、溶菌酶、凝集素和抗菌肽等免疫相关分子，提供化学保护以抵抗细菌入侵。聚糖结构在系统发育谱系中存在差异，其快速进化以逃避病原体和微生物降解。然而，在保护宿主免受病原体入侵的同时，聚糖也吸引并滋养有益微生物，可能构建微生物组。
目前对软骨鱼类黏蛋白谱的了解仅限于三种物种，其独特的聚糖组成与硬骨鱼类存在显著差异，可能在宿主-微生物相互作用和免疫防御中具有功能意义。软骨鱼类三个分支（鲨、鳐、魟）的表皮微生物组具有物种特异性并遵循宿主系统发育。鲨鱼微生物组的种内变异较低，而魟类同种个体间的微生物组变异较大，这可能反映了黏液的高周转率。尽管这些类群在水体中丰度较低，但鲨鱼和魟类皮肤上富含革兰氏阴性菌，表明无论是盾鳞皮肤还是黏液皮肤都具有选择性。
本研究首次通过鸟枪法宏基因组学将黏液化学（单糖组成）与微生物基因功能联系起来，旨在描述四种软骨鱼类黏液的单糖组成，并利用宏基因组学鉴定微生物功能，以揭示微生物组与软骨鱼类黏液之间的相互作用。
材料与方法：样本收集与分析流程
研究在澳大利亚南澳大利亚州对七种软骨鱼类进行了表皮黏液和微生物样本采集。鹰魟使用围网捕获，而扁鲨、白斑鳐、杰克逊港鲨和一只鹰魟则是在南澳大利亚研究与发展研究所（SARDI）的观察性拖网捕虾作业中作为兼捕物偶然捕获。所有个体在采样后被放归大海。
微生物组样本使用装有无菌海水的“超级抽吸器”收集，通过轻轻按压皮肤并推动活塞，冲洗皮肤并将含有微生物的液体回收，经过滤后保存在-80°C。海水微生物组样本来自圣文森特湾的不同地点。
黏液采集面临软骨鱼类表皮盾鳞和黏液量少的挑战。传统刮擦工具因盾鳞阻碍而效果不佳。研究开发了一种使用带纹理的聚氨酯涂层手套的方法，使手套能贴合鱼体轮廓刮下黏液，每次成功样本可收集2-4毫升黏液。黏液样本在船上冷冻后，在实验室用液氮冷冻并储存在-80°C。
碳水化合物分析：揭示黏液单糖组成
黏液样本通过冷冻干燥和脱盐进行预处理。高盐含量使得样本必须脱盐以保护仪器。采用高效液相色谱法（HPLC）结合二极管阵列检测器（DAD）对水解和衍生化后的样本进行单糖分析。使用包括甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖在内的标准品进行鉴定和定量。此外，使用Bradford蛋白测定法对部分有足够生物量的样本进行了水溶性蛋白浓度定量。
微生物基因分析：解码微生物功能潜能
从Sterivex滤膜中提取DNA，经超声破碎后建库，在Illumina NextSeq平台上进行测序。使用内部管道“Atavide”对测序得到的宏基因组进行分析，包括质量控制和宿主序列过滤。基因功能使用mmseqs2比对UniRef数据库进行注释，并依据SEED子系统层次结构进行分类，重点关注碳水化合物代谢和膜运输等子系统。基因数据经过标准化（相对丰度）处理以进行后续比较。
结果：宿主特异性黏液与微生物的代谢适配
黏液组成：低糖含量与关键单糖
从宿主收集的黏液生物量低（<2%），平均含水量高（>90%）。研究定量了四种软骨鱼类黏液中的八种单糖丰度。总体而言，每种物种黏液中的碳水化合物含量较低，介于干重的0.08%至9.16%之间。葡萄糖、葡萄糖胺、半乳糖和岩藻糖是关键单糖，几乎存在于所有测试个体中。在所有宿主物种中，葡萄糖在黏液碳水化合物中占比最大（介于0.11%至3.44%之间）。
鹰魟黏液的碳水化合物比例最高，占生物量干重的3.43%至9.16%。白斑鳐黏液中岩藻糖比例最高，鹰魟黏液中葡萄糖胺比例最高。阿拉伯糖仅在鳐类黏液中被检出，而核糖仅在鹰魟黏液中被检出。
黏液组成在鹰魟、鳐类和扁鲨之间进行比较。鹰魟和鳐类黏液组成存在显著差异。尽管缺乏统计学显著性，但鹰魟样本（尤其是个体样本）在非度量多维尺度分析（NMDS）图中聚集紧密，而鳐类黏液则表现出更高的变异性。
鹰魟表皮黏液中的可溶性蛋白浓度范围为19.05至50.24微克/毫克，而单一的杰克逊港鲨样本浓度为16.76微克/毫克。
微生物基因：碳利用倾向与特异性代谢通路
对12条扁鲨、9条鹰魟、15条杰克逊港鲨、18条白斑鳐和20个水体样本的表皮微生物群落进行了比较。水体微生物中光合作用基因与呼吸作用基因的平均比例约为1:5，而宿主微生物组中约为1:19，表明水体微生物产生碳，而宿主微生物利用碳。
尽管碳水化合物代谢（子系统1级）存在于所有宏基因组中，但水体宏基因组中碳固定（子系统2级途径）的平均相对丰度（30.4%）高于宿主相关宏基因组（25.0%）。鹰魟在宿主相关宏基因组中碳固定基因比例最低（20.0%），表明其皮肤上有现成的碳源。宿主宏基因组中单糖、二糖/寡糖和多糖的平均相对丰度均高于水体宏基因组。
聚焦于三类糖组内的子系统分布，所有宿主的微生物组都拥有利用黏液中所含糖分的基因。D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖醛酸利用途径在所有宿主中都具有较高的相对丰度，而在水体微生物组中较低。半乳糖利用途径约占碳水化合物基因的12%–14%。乳糖（由葡萄糖和半乳糖构成的二糖）利用在宿主相关宏基因组中的相对丰度约为3%。糖原代谢在鲨鱼和魟类微生物组中的相对丰度在10%至13%之间，但在葡萄糖分子罕见的水体中仅为5%。1%）微生物功能基因（子系统3级）。">
L-岩藻糖利用在鹰魟中最高（15.0%），而在扁鲨（1.6%）和鳐类（1.2%）中较低。D-葡萄糖胺利用在所有微生物组中几乎缺失，表明作为聚糖核心成分的葡萄糖胺未被微生物直接利用。阿拉伯糖利用途径占比小于1%，且宏基因组中总体丰度可忽略，这与黏液缺乏阿拉伯糖一致。未在任何软骨鱼类宏基因组中鉴定到木糖或鼠李糖利用基因，表明皮肤细菌极少或完全缺乏这些基因。
与水体微生物组相比，糖原代谢在鲨鱼和魟类微生物组中的相对丰度是其两倍，反映了黏液中聚糖的可利用性。在糖原代谢途径中，4-α-葡聚糖转移酶（淀粉麦芽糖酶）（EC 2.4.1.25）和糖原磷酸化酶（EC 2.4.1.1）在鹰魟皮肤上丰度最高。相比之下，聚糖合成途径在水体中更丰富，特别是ADP-葡萄糖转葡糖基酶（EC 2.4.1.21），这是一种构建碳水化合物的途径基因，表明有更多基因可用于葡萄糖的合成。
聚糖和多糖利用系统（PULs, Sus）途径属于膜运输分类。这组基因在宿主和水体宏基因组中以相似比例存在。Sus操纵子中的四个基因（SusA, D, C和R）存在于宿主宏基因组中。
讨论：黏液作为选择性碳源塑造表皮微生物组
本研究描述了软骨鱼类表皮微生物的代谢潜能和黏液碳水化合物，首次揭示了微生物与软骨鱼类宿主之间的相互作用。研究发现软骨鱼类黏液碳水化合物比例低，以四种单糖（葡萄糖、半乳糖、葡萄糖胺和岩藻糖）为主。相关微生物群落拥有检测这些单糖、将其转运进细胞并作为碳源利用的基因。尽管宏基因组学不能确认基因表达，但这些基因的丰度表明表皮微生物组适应了鲨鱼和魟类体表的生活，在那里它们有可能消耗碳，而非像周围水体中以光合作用为主的微生物那样生产碳。
黏液单糖组成的种间差异与核心成分
碳水化合物占所有软骨鱼类样本黏液总生物量的不到10%，与珊瑚黏液（碳水化合物占比高达80%）形成鲜明对比。在鲨鱼和魟类中，单糖的多样性及其相对丰度因物种而异，但有几个关键单糖在各类群中都很丰富。鹰魟含有七种单糖，其中葡萄糖和葡萄糖胺最为丰富。相比之下，扁鲨的特有单糖种类最少（4种）。珊瑚黏液中常见的阿拉伯糖和甘露糖在软骨鱼类黏液中缺失。相反，软骨鱼类黏液以葡萄糖胺、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖为主。单糖的相对丰度在不同软骨鱼类物种间存在差异，类似于不同珊瑚类群间黏液成分的变异性。鹰魟的黏液成分一致，而鳐类黏液的单糖成分变异性更高。鱼类表皮黏液随环境条件变化而波动，表明黏液环境是动态的。因此，需要进一步研究以了解软骨鱼类黏液上糖浓度随环境条件变化的程度。
在所有存在的单糖中，半乳糖、葡萄糖胺和葡萄糖存在于所有宿主中且丰度最高。鲨鱼和鱼类黏液富含由这些单糖构成的糖蛋白。这三种单糖是所有动物中已识别的八种核心聚糖结构的基本组成单元，其他单糖可添加其上产生多样化的O-聚糖。半乳糖连接在核心1和核心2聚糖结构的基础N-乙酰半乳糖胺上，这是八种核心聚糖中最常见的。核心1和核心2聚糖在软骨鱼类（包括角鲨、小鳐和链猫鲨）皮肤黏液中含量丰富，在硬骨鱼类如北极红点鲑和大西洋鲑的肠道黏液中也是如此。在所有已测量的软骨鱼类中半乳糖的存在和丰度表明，核心1和2聚糖可能是黏液的组成部分，并且在形成黏液寡糖中很重要，但含半乳糖的糖蛋白的生物学作用尚不清楚。
N-乙酰半乳糖胺残基连接丝氨酸或苏氨酸氨基酸形成核心聚糖结构，而添加N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）则形成核心2、3、4和6 O-聚糖。葡萄糖胺存在于所有鲨鱼和魟类中，类似于五种珊瑚物种，表明它是跨类群保守的关键黏液单糖。N-乙酰葡萄糖胺作为一种保护机制，在实验室条件下抑制大肠杆菌的生物膜形成。与鲨鱼和魟类相关的常见细菌弧菌的运动菌株代谢末端N-乙酰葡萄糖胺以侵入宿主免疫系统，而不能代谢N-乙酰葡萄糖胺的菌株不运动且致病性降低。
微生物的代谢基因与黏液单糖的对应关系
微生物组中的单糖基因，包括半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸利用基因，在所有宿主物种的微生物组中都具有相当高的相对丰度，尤其是在鹰魟中。半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸途径中最丰富的功能是α-葡萄糖苷酶。α-葡萄糖苷酶通过切割α-1-4糖苷键分解多糖，释放游离葡萄糖，表明共生细菌有可能分解复杂糖类以利用碳作为能源。
在二糖和寡糖利用子系统中，存在17个半乳糖代谢基因。UDP-葡萄糖-4-差向异构酶、α-半乳糖苷酶和钠依赖性半乳糖转运蛋白是半乳糖代谢子系统中最丰富的。UDP-葡萄糖-4-差向异构酶是一种将半乳糖代谢为葡萄糖的酶。在人类婴儿肠道微生物组中，长双歧杆菌能有效代谢人乳寡糖和黏蛋白聚糖中的O-聚糖。α-半乳糖苷酶是一种能够从较长的寡糖分子上切下半乳糖残基的酶。钠葡萄糖转运蛋白调节葡萄糖摄取进入细胞。表皮微生物组拥有高丰度的分解复杂寡糖和从环境中摄取单糖的酶，这表明细菌拥有代谢软骨鱼类黏液中所含糖分的基因型。
白斑鳐黏液含有高浓度的岩藻糖，这与小鳐黏液聚糖一致。此外，在软骨鱼类皮肤上鉴定到了与岩藻糖基化相关的蛋白质。同样，研究在宏基因组中发现了高相对丰度的岩藻糖利用基因，支持了Bachar-Wikstrom等人的假设，即鲨鱼黏液中的蛋白质岩藻糖基化调节宿主-微生物组通讯和免疫。鹰魟的L-岩藻糖利用基因相对丰度尤其高（平均15%），表明细菌有可能利用黏液层中的岩藻糖作为能源。
糖原代谢与聚糖利用系统
与水体宏基因组相比，糖原代谢在软骨鱼类微生物组中也呈现过表达。在该子系统内，糖原磷酸化酶和α-1,6-麦芽四糖水解酶在软骨鱼类微生物组中具有高相对丰度。糖原磷酸化酶分解聚合物释放葡萄糖以供利用。α-1,6-麦芽四糖水解酶是一种“脱支酶”，可水解α1-6糖苷键以分解糖原。与水体相比，糖原代谢基因在鲨鱼微生物组中过表达，因此如果这些基因表达，它们可能正在分解宿主黏液。在野生豹纹鲨表皮微生物组中，碳水化合物代谢基因具有高相对丰度，且17种最丰富细菌中的15种携带糖酵解途径基因。在两种魟类的表皮微生物组中，功能分析鉴定出高比例的碳水化合物代谢相关基因和低丰度的光合作用基因。从这些宿主中获得的宏基因组组装基因组（MAGs）都拥有利用单糖、二糖/寡糖的基因，但糖醇基因丰度较低。相比之下，更复杂多糖的利用在五个细菌物种中的四个（除红杆菌科外）具有高丰度。此外，与半圈养和野生个体相比，圈养豹纹鲨表皮宏基因组中编码分解这些糖类的酶（如β-葡萄糖苷酶）的基因相应更高，表明在圈养条件下，由于游泳速度降低或营养可用性增加，鲨鱼身上的黏液分泌可能增加。
转运系统：营养获取的关键
除了分解黏液碳水化合物所需的特定酶外，细菌还需要将这些碳水化合物转运进细胞。聚糖和多糖利用系统（PULs, SUS）属于膜运输分类。拟杆菌属中的Sus操纵子包含八个基因（SusRABCDEFG），它们促进碳水化合物的识别、结合和转运进入细菌细胞。四个Sus基因（R, A, C和D）出现在所有软骨鱼类表皮微生物组中。这些基因在拟杆菌属中已有详细描述，该属拥有代谢宿主O-聚糖的多糖利用基因座，而乳杆菌则能有效结合黏液聚糖。Sus R（识别聚糖）和Sus D（结合聚糖）的存在表明，来自鲨鱼和魟表皮的细菌能够感知并结合黏液寡糖。
转运蛋白基因，包括Ton和Tol转运系统，在软骨鱼类微生物组中以高相对丰度存在。来自两种魟的所有MAGs都含有高丰度的糖转运蛋白基因。鲨鱼和魟类微生物组含有必要的糖苷酶（α-葡萄糖苷酶和半乳糖苷酶）和脱支酶，它们完善了Sus途径，表明它们直接利用聚糖。鲨鱼皮肤中的黏蛋白被认为可为有益微生物提供营养，而我们的宏基因组数据提供了证据，表明鲨相关微生物拥有处理复杂碳水化合物的遗传机制。需要进一步的转录组学或基于培养的实验来证实这些关系。本研究首次为四种先前未探索的野生软骨鱼类提出了宿主表皮黏液单糖与表皮微生物组（基因功能潜能）之间相互作用的概念模型。
研究局限与挑战
许多软骨鱼类黏液量少是描述鱼类和鲨鱼黏液成分的主要障碍。软骨鱼类黏液弹性高，难以从表皮表面去除。低样本量是描述鱼类黏液成分的重大障碍，本研究在软骨鱼类中也证实了这一点。组织法（用组织吸收表面黏液）可从鲨鱼获得约1毫升黏液，当汇集多个个体时，已成功用于蛋白质和聚糖鉴定。然而，本研究旨在将黏液与微生物基因直接比较，因此保持个体黏液分离很重要。研究尝试从84个个体收集黏液，发现对于许多生物，黏液无法被组织吸收，可能是由于黏液成分或黏液位于盾鳞下的位置。鲨鱼和魟类的黏液含有高浓度的盐分（冲洗前高达干质量的93%），这需要为HPLC分析去除，进一步增加了所需样本量。从鱼类获取黏液的第二种主要方法是用工具刮擦皮肤，虽然该方法通常能从鱼类黏液中获得更高浓度的蛋白质，但会造成损伤并用血液污染样本。研究优先考虑对个体的采样，导致样本量相对较小，因此结果提供了软骨鱼类黏液单糖浓度的初步分析。
结论：黏液作为微生物群落的选择性调节因子
本研究首次描述了四种软骨鱼类宿主黏液的单糖组成，并确定了共生细菌利用黏液作为碳源的基因。研究发现跨物种存在四种关键单糖（葡萄糖、半乳糖、葡萄糖胺和岩藻糖），它们是其他软骨鱼类物种黏液聚糖的组成部分。每种软骨鱼类物种的黏液具有不同的单糖成分，鹰魟和白斑鳐之间存在显著差异。编码碳水化合物途径的微生物基因在宿主微生物组中的丰度通常高于水体微生物组。总体而言，与水体微生物组相比，软骨鱼类微生物组拥有更高比例的碳利用基因，以及更低比例的光合作用基因，表明黏液是这些共生微生物的重要营养来源。软骨鱼类表皮微生物拥有检测、转运和代谢宿主黏液中所含单糖及其他碳水化合物所需的遗传机制，证实了黏液是微生物组的一种选择性机制。
