《Nature Methods》：Scaffolds with optimized quaternary symmetry for de novo cryoEM structure determination of small RNAs
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本文展示了通过工程化具有C2和D2对称性的RNA支架，成功解决了单域小RNA（~100 nt）难以进行高分辨率冷冻电镜（cryoEM）结构解析的长期难题。该方法将目标RNA（“客体”）共价连接到优化的支架（“主体”）上，利用支架的固有对称性显著提升了颗粒大小、对中效率和图像质量，使整体分辨率达到优于3 ?，成功应用于包括转运RNA（tRNAAsp）、荧光适体（Mango-III）以及新发现的奎宁和8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）适体在内的多种RNA结构从头解析，揭示了其与小分子配体、阳离子及水分子相互作用的原子细节，为RNA结构生物学和理性设计提供了强有力的新工具。
文章内容归纳总结
设计具有优化二聚体产率的宿主RNA支架
研究的起点是劳斯肉瘤病毒（RSV）的移码刺激元件（FSE），其约15%在溶液和冷冻电镜载网上可形成二聚体。每个原体包含五个配对元件和两个假结。为了增强四级结构的形成，研究人员对亲本RNA进行了改造，包括截短P3结构域、删除特定残基（C2500）并引入多个点突变（如U2564G、U2579A、C2578A、C2582U），以优化二聚化螺旋（PD）。其中，构建体RSV2还包含了核心突变A2546G，该突变在体外可增强约0.5倍的移码效率。优化后的构建体（99 nt，约33 kDa）通过尺寸排阻色谱（SEC）筛选，其二聚体产率显著优于原始变体。在优化的折叠条件下，这些RNA无需进一步纯化即可直接用于冷冻电镜制样。显微照片显示，大多数颗粒为“花生”状的二聚体。经过分类和精修，获得了C2对称性、分辨率约3.5-3.6 ?的密度图。与亲本RSV FSE类似，RSV1和RSV2二聚体也通过互补的碱基堆积相互作用（一个原体的P1堆叠在另一个原体的PK2上）来稳定。三维变异性分析表明，颗粒存在垂直于主轴的“弯曲”运动。
将优化的四级结构支架应用于tRNAAsp和iMango-III A10U
接下来，研究人员使用优化的RSV FSE变体RSV2（简称2OP）来设计嵌合RNA，用未经修饰的大肠杆菌tRNAAsp（2OP–tRNAAsp）或iMango-III A10U荧光适体（2OP–Mango）替换P3的顶端部分。在每种情况下，连接客体和主体的茎中都引入了非标准碱基对，作为该区域图谱质量的内标。SEC分析表明，2OP–tRNAAsp主要是二聚体，而2OP–Mango是多种寡聚态的混合物。
显微照片清晰显示了对应于客体的额外密度。对于2OP–tRNAAsp，由于反密码子环间的相互作用，偶尔会形成盒状颗粒。使用在无客体的支架上预训练的Topaz模型可以高效地进行初始颗粒挑选。tRNA部分的对齐相对较差，三维变异性分析表明存在导致tRNA部分位移高达约10-15 ?的弯曲运动。通过对对称性扩展的颗粒进行局部分区精修，tRNAAsp的密度图分辨率提升至3.7 ?。在最终密度图中，可以识别tRNA的整体形状和沟槽，以及在最佳分辨区域可辨别碱基配对。分辨率最低的区域包括肘部和反密码子环的部分。D环中未修饰的尿苷U19和U20的构象在冷冻电镜密度图中有些模糊，但似乎更接近之前晶体结构中A链的构象以及与天冬氨酰-tRNA合成酶（AspRS）复合物中修饰tRNAAsp的构象。U47的构象在晶体结构中向外翻出，而在本研究的样品中，其密度显示其向内翻向A21，这种内翻构象与tRNAAsp–AspRS复合物中观察到的构象更为相似。总体而言，该宿主-客体方法产生的冷冻电镜重构图谱质量足以区分完全转录后修饰的tRNAAsp与本研究中未修饰tRNAAsp之间的构象差异。
对于研究的最小客体iMango-III A10U，这是一种利用RNA四链体结合位点结合其条件性荧光团（TO1-biotin）的荧光适体。研究人员收集了其未结合（apo）和配体结合状态的数据，整体重建分辨率约为3.0 ?，但客体部分分辨率较低。与结合TO1-biotin的2OP–Mango相比，未结合状态的2OP–Mango的客体部分分辨率很差，仅能对连接螺旋的一部分进行建模。配体结合状态下的冷冻电镜密度图与iMango-III A10U的晶体结构整体一致，可以进行刚性对接。这些图谱表明，TO1-biotin荧光团的结合极大地减少了该“开启”式适体所采样的构象空间。
支架化的U1A RNA-蛋白质复合物形成D2对称性四聚体
为了研究小型核糖核蛋白复合物（RNP）的结构，研究人员将U1A蛋白的茎环连接到2OP支架上（2OP–U1A），在制样前将RNA与U1A蛋白混合。得到的冷冻电镜重构显示，2OP–U1A的客体部分分辨率很差（未建模），但宿主部分采用了D2对称性的四级结构。这种更高的对称性使平均后的冷冻电镜密度图分辨率达到2.7 ?。精修后的结构显示，尽管D2对称性2OP RNA的序列与C2对称性RNA相同，但其采用了不同的碱基配对方案。在D2结构中，一段富含C的序列滑动，导致5’端的C2575向外翻出，随后的C与第二个二聚体中的碱基发生配对。值得注意的是，D2四聚体也存在于未结合状态的2OP–Mango中，但这些颗粒存在明显的择优取向，这可能是由于暴露的G-四链体疏水面粘附在气-水界面所致。通过以45°倾角收集数据解决了择优取向问题，但最终得到的密度图质量略有下降。
奎宁适体通过形状互补性识别其配体
通过将细菌腺嘌呤核糖开关的适体结构域进行随机化并体外筛选，最近发现了能够特异性识别抗疟药奎宁的RNA。研究人员将奎宁-I适体序列融合到2OP支架上（2OP–奎宁），并处理了C2对称颗粒的冷冻电镜数据。得到的库仑势密度图质量极佳，局部分区精修后，宿主核心分辨率达2.7 ?，奎宁适体部分达2.9 ?。这允许对完整的奎宁-I适体进行从头链追踪。密度图的高质量是显而易见的，例如对应于适体中非经典U40•C98碱基对的部分与相邻的沃森-克里克碱基对明显不同。
奎宁适体的整体折叠与其亲本核糖开关密切相关，由三个配对元件（P1–P3）通过连接环J1/2、J2/3和J3/1连接而成。配体结合口袋位于三向连接处，这是奎宁适体密度图中分辨率最佳的区域。P2和P3螺旋的远端环在适体尖端形成环-环相互作用。奎宁结合位点由来自J1/2、J2/3和J3/1的残基组织而成，特别是J2/3中的30-37位残基形成了一系列连续的三级相互作用并直接接触配体。适体核心中的经典和非经典碱基对紧密地补充了奎宁的特征形状。G38•C59堆叠在喹啉环上方，几乎垂直于G38•C59的U9•A37与奎宁环的奎宁环部分发生范德华相互作用。A8和A36通过单个氢键相互作用，两者也都与奎宁的羟基形成氢键，这是观察到的仅有的两个RNA-配体氢键。G60堆叠在喹啉环下方并与C35配对，而C35又堆叠在A36上。由于A36位于喹啉环和C35•G60之间，后者不与喹啉环或G38•C59共面。该结构与之前报道的G60A突变会损害枯草芽孢杆菌中奎宁适体报告基因活性的结果一致。
细菌8-氧代鸟嘌呤核糖开关通过氢键网络包裹其配体
鸟嘌呤的氧化损伤产物8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）可被一类迄今尚未解析结构的细菌核糖开关识别。研究人员将8-oxoG适体序列融合到2OP支架上（2OP–8-oxoG）进行结构测定。颗粒采用了D2对称性的四聚体形式，这有助于从Glacios显微镜（200 kV）收集的筛选数据中获得约3.3 ?分辨率的密度图重构，而从Krios显微镜（300 kV）收集的数据则使宿主核心分辨率达到约2.5 ?，8-oxoG适体客体分辨率达到约2.9 ?。利用局部分区精修的密度图可以轻松地对整个核糖开关适体RNA进行追踪，并确定了2OP–8-oxoG的完整结构。核心局部分区精修密度图中最佳分辨区域揭示了许多有序水分子、水合Mg2+离子以及几个残基的交替构象的位置。三维变异性分析捕捉了四聚体宿主核心中二聚体之间的倾斜运动。
正如同源性预测，8-oxoG核糖开关适体结构域的整体结构与嘌呤、脱氧鸟嘌呤和四氢叶酸（THF）核糖开关相似。与嘌呤核糖开关和上述奎宁适体类似，J2/3中的残基参与了与配体结合口袋附近残基的众多三级相互作用，并直接接触结合的配体。局部分区精修密度图中最佳分辨区域显示了8-oxoG结合位点如何由堆叠相互作用和氢键组成，与8-oxoG的七个氢键供体和受体相互作用。类似于嘌呤核糖开关中鸟嘌呤的相互作用，C58与8-oxoG的沃森-克里克面形成氢键，U35与8-oxoG的胡格斯廷面形成氢键，U8的2′-OH与8-oxoG的N7形成氢键。8-oxoG适体的独特之处在于，A7的2′-OH与8-oxoG的O8基团形成氢键。附近的嘧啶C32和C34与堆叠在结合8-oxoG两侧的U8•A36和A7•U59碱基对形成三级相互作用。这种三级相互作用排列为鸟嘌呤中不存在的O8取代基留出了空间，这与鸟嘌呤结合8-oxoG适体的能力比8-oxoG弱约十倍的结果一致。
讨论
本研究证明，具有固有C2或D2对称性四级结构的优化RNA支架，能够通过单颗粒冷冻电镜对合成和天然RNA客体进行从头结构测定。该方法可普遍应用于三维结构未知但具有预测或假设二级结构的RNA，这些RNA可以很容易地融合到优化的宿主上。经验表明，经过常规纯化和折叠后，无需对嵌合RNA进行进一步纯化，从而加快了制样和密度图生成的速度。数据分析和电镜时间最终成为限速步骤。支架连接可能稳定客体，特别是当连接客体的螺旋具有动态性时。对于奎宁适体和8-oxoG核糖开关适体结构域，在模型构建过程中，通过结合客体和核心模型来确定序列登记。
冷冻电镜结构测定中支架的使用，原则上会影响方法学的各个方面，包括样品稳定性与折叠、颗粒挑选、对齐和平均。样品的分子量增加、稳定性和均一性改善以及颗粒的对称性在多大程度上改善了最终重构和原子模型，这很难分解。最近报道的游离tRNA的重构是目前通过单颗粒冷冻电镜研究的最小RNA分子之一，分辨率限制在4.5-5 ?。相比之下，我们使用C2对称支架获得的tRNA重构分辨率约为3.7 ?。在本方法中，C2或D2对称性被应用于所有最终核心的局部分区精修，因为这些密度图仍具有内部对称性。比较有对称和无对称的核心精修结果表明，对于更高分辨率的数据集，每增加一倍的对称性可使分辨率提高约0.1 ?。
支架的应用要求客体在其5′和3′端之间形成一个由碱基配对构成的螺旋，这是紧凑RNA的常见结构特征，但对于假结则可能不适用，因为假结的末端通常在空间上相距较远。对于假结，可以设想使用我们RSV FSE衍生支架的排列变体，连接其天然的5′和3′端，它们在二聚体中并列并相互堆叠。将新的5′和3′端置于P3，从而允许在P3位置包含假结RNA，甚至可以利用“粘性末端”以反式添加客体。可以设想一种未来的方法，将支架和未知的RNA或DNA以反式混合，从而能够快速筛选工程化支架和靶标客体。支架和靶标都可以包含旨在便于快速进行下游结构鉴定的修饰。
由于我们的四级结构支架是从一种促进移码的病毒RNA基因组元件改造而来，其序列保留了作为结构测定工具所不需要的密码子级信息。此外，二聚化与其病毒功能本身并无已知联系，其天然功能与在冷冻电镜载网上的行为之间除了工程化的寡聚化赋予了样品稳定性外，本身并无关联。因此，原则上我们的对称支架未来可以进一步改造，成为更好的冷冻电镜样品，例如，通过抑制弯曲运动或促进四聚化。四聚体颗粒最终产生了我们最佳的密度图；然而，目前尚不清楚为什么一些宿主-客体复合物形成了四聚体，而另一些则没有。具有更高对称性的RNA颗粒可能被发现并以类似方式应用，即使对称性与生物功能无关，这将进一步增强我们所描述方法的威力。
