单细胞解析髓外多发性骨髓瘤（EMM）免疫微环境：揭示低效应细胞比例、CD8+T细胞耗竭与CD16?NK细胞富集

《Blood Cancer Discovery》：Schematic overview of our key findings on the EMM TME. EMM lesions are domi... Open Access

本研究是首个利用单细胞RNA测序、流式细胞术和空间转录组学，对髓外多发性骨髓瘤（EMM）病变与其配对及非配对骨髓（BM）肿瘤微环境（TME）进行全面、直接比较的综合性研究。文章揭示了EMM的免疫抑制特征：效应细胞（E）与肿瘤细胞（T）比例（E:T ratio）极低，半数患者中存在高比例的、对肿瘤抗原（neoantigen）有反应的耗竭性CD8+T细胞，以及大量低细胞毒性的调节性CD16?NK细胞富集。这些发现为EMM对包括现代免疫疗法在内的多种治疗耐药提供了机制解释，并为开发联合免疫检查点（如PD-1, KLRC1/NKG2A）阻断等新策略提供了重要依据。

　　

摘要

髓外多发性骨髓瘤（Extramedullary Multiple Myeloma, EMM）是多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）的一种高危临床特征，与对包括现代免疫疗法在内的多种治疗耐药性增加及生存期缩短相关。然而，EMM肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中免疫细胞的组成和功能状态仍不清楚。本研究综合运用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、流式细胞术（flow cytometry, FCM）和空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）技术，揭示了EMM TME与MM骨髓（bone marrow, BM）微环境相比存在显著差异。

引言

髓外病变（Extramedullary Disease, EMD）是由侵袭性MM克隆从骨髓中逸出并在体内新生态位有效定植引起的高危临床特征。EMM细胞对传统药物和现代免疫疗法（如单克隆抗体、双特异性抗体、CAR-T细胞）均表现出更高的抵抗性。先前研究提示EMM的侵袭性可能与肿瘤内在因素（如增殖增加、突变负荷更高）和特定的遗传背景相关。当前MM治疗策略越来越多地利用免疫疗法，特别是T细胞和NK细胞等效应细胞来对抗肿瘤。尽管先前研究报道了EMM微环境中肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs）丰度相对较低以及CD8⁺T细胞存在一定程度的耗竭，但EMM与BM MM之间免疫效应细胞组成和功能状态的直接比较仍然缺乏。

结果

患者特征

EMM和复发/难治性多发性骨髓瘤（Relapsed/Refractory Multiple Myeloma, RRMM）队列在性别、诊断时的国际分期系统（International Staging System, ISS）分期、既往治疗线数等临床特征上基本平衡。然而，EMM患者取样时年龄明显更小，复发时BM浆细胞（Bone Marrow Plasma Cells, BMPC）水平显著更低，而乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）水平在EMM队列中显著更高。空间转录组学验证队列包含8名EMM患者的独立数据。

EMM肿瘤与MM骨髓微环境的整体构成

scRNA-seq分析显示，EMM肿瘤主要由恶性浆细胞（Plasma Cells, PC）、T细胞和NK细胞组成，分别占中位比例为91.9%、4.3%和1.5%。相比之下，EMM患者的BM样本中恶性PC浸润极少，优势细胞群为中性粒细胞、T细胞、单核/巨噬细胞、红系前体细胞和NK细胞。与无EMM证据的RRMM BM样本相比，EMM病变中效应细胞（T和NK细胞）与恶性PC的比值（E:T ratio）显著降低。流式细胞术分析结果与scRNA-seq一致，均证实EMM病变以恶性PC为主，且E:T比极低。scRNA-seq数据还显示，与RRMM_BM样本相比，EMM中的恶性PC在S–G₂–M期的比例更高，与增殖相关的通路（如E2F_targets和G₂–M checkpoints）富集。

scRNA-seq鉴定出多样化的T细胞和NK细胞亚群

对T/NK细胞簇的深入分析鉴定出14个不同的亚群，包括12个T细胞簇和2个NK细胞簇。后者被归类为CD16⁺细胞（NCAM1/CD56表达较低）和CD16^?细胞（NCAM1/CD56表达较高）。与CD8⁺T细胞和NK细胞相比，EMM病变中CD4⁺T细胞的浸润有限，主要以调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg）、CD4效应和CD4初始T细胞为代表。

EMM肿瘤中的CD8⁺T细胞通常比其BM对应细胞更耗竭

对配对样本的分析显示，近半数配对的EMM样本（2/4）与对应的BM样本相比，CD8⁺T细胞的耗竭评分（exhaustion score）显著升高，且高耗竭评分与细胞毒性（cytotoxicity）降低呈强负相关。在EMM样本中，最耗竭的CD8_exhausted-like TOX亚群几乎只存在于EMM中，而细胞毒性评分最高的亚群（CD8_effector_CX3CR1和CD8_EM_GZMK）在EMM中的比例显著低于BM样本。流式细胞术也证实，EMM样本中PD-1阳性的T细胞比例显著高于BM样本。传统亚群分析显示，CD8⁺和CD4⁺T细胞中的初始（na?ve）细胞比例在RRMM_BM、EMM_BM到EMM样本中呈逐步下降趋势。

EMM肿瘤中T细胞耗竭似乎由直接的细胞-细胞相互作用驱动

为了探究EMM队列中T细胞耗竭评分高变异性的潜在驱动因素，研究者对高耗竭组与低耗竭组患者进行了差异细胞-细胞相互作用分析。结果显示，高耗竭组中EMM细胞与T/NK细胞之间的HLA-B:CD8A相互作用更强，这源于高耗竭组EMM细胞中HLA-B、HLA-A和HLA-C的表达显著更高。值得注意的是，CD8_exhausted-like TOX簇表现出比其他T细胞亚群更强的新抗原反应性T细胞基因表达特征。综合来看，高T细胞耗竭样本中EMM细胞HLA基因表达增加，以及耗竭T细胞中强的新抗原反应特征，表明EMM中的T细胞耗竭可能是由与肿瘤PC的直接相互作用驱动的。

EMM肿瘤微环境中调节性CD16阴性NK细胞比例