《Phyton-International Journal of Experimental Botany》：Keystone Fungal Endophytes of
Panax Plants Drive the Conversion of Ginsenoside Rb1 to Rd
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本研究为解决“在复杂的内生真菌群落中，如何识别并阐明具有重要生物转化功能的核心（keystone）类群”这一问题，通过整合生态网络分析、共培养验证与全基因组测序，揭示了人参属（Panax）植物根和叶中的关键内生真菌Plectosphaerella（Plec）和Cladosporium（Clad）可将人参皂苷Rb1高效转化为Rd，并阐明了其与β-葡萄糖苷酶活性相关的基因组特征。该工作为定向开发功能性内生真菌资源以转化植物特化代谢物提供了新见解。
在植物的“体内世界”中，居住着庞大而多样的内生微生物群落，它们与宿主植物共生，影响着植物的生长、发育和适应性。然而，这个微观世界的“居民”并非地位平等。生态学理论指出，微生物群落中存在着少数被称为“关键类群”（keystone taxa）或“枢纽类群”的核心成员，它们通过广泛的相互作用，对维持群落稳定和塑造生态功能起着至关重要的作用。如何从复杂的微生物群落中，精准识别出这些功能未知但地位关键的“核心玩家”，并阐明它们发挥作用的分子机制，是当前微生物生态学与功能微生物资源开发面临的一大挑战。与此同时，在传统中药领域占据重要地位的人参、西洋参、三七等珍贵人参属（Panax）植物，其核心药效成分是人参皂苷。这些皂苷不仅是植物的“化学武器”，用以防御病原和害虫，也深刻影响着其内生微生物群落的结构。一个有趣且尚未解答的科学问题是：人参属植物内生群落中的关键真菌，是否能够“改造”由皂苷构成的化学防御微环境，从而在其中立足并发挥枢纽作用？为了回答这一问题，来自天津中医药大学的研究团队开展了一项综合性研究，相关成果发表在《Phyton-International Journal of Experimental Botany》上。
研究者们综合运用了多种关键技术方法来系统探究上述问题。研究首先进行了大规模的样本采集，从人参、西洋参和三七各自的核心产区，采集了不同生长年限（2年、3年、4年）植株的根和叶组织，共计81个样本。基于这些样本，通过扩增子测序（针对真菌内部转录间隔区ITS）构建了根和叶内生真菌群落的生态网络，并依据节点连接度（degree）和中介中心性（betweenness centrality）两项拓扑学指标，识别出网络中的关键真菌类群。接着，从三七组织中分离、培养并纯化出代表性关键菌株。通过体外共培养实验结合高效液相色谱（HPLC）分析，验证了菌株对混合人参皂苷的转化能力，并利用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）法测定了其β-葡萄糖苷酶活性。为了深入解析机制，研究团队对分离得到的两株关键真菌进行了全基因组测序（结合PacBio和Illumina平台进行混合组装），并开展了系统的基因组注释、比较基因组学、基因家族进化以及转录组（RNA-seq）分析，以揭示其基因组特征和潜在的功能基因。
3.1. 基于生态网络识别人参属组织中的关键真菌内生菌
通过构建根和叶内生真菌的生态网络，研究发现叶际网络的节点和连接数多于根际网络，且两个网络均以正相互作用（可能为互利共生）为主。根据高连接度（>20）和高中介中心性（>5000）的标准，分别在根和叶网络中鉴定出32个和167个关键操作分类单元（OTUs）。在属水平上，Plectosphaerella（Plec）和Cladosporium（Clad）分别是根和叶内生区室中占比最高的关键类群。相关性分析进一步显示，根中Plectosphaerella的相对丰度与多种人参皂苷（Rg1, Re, Rd, NR1）含量呈显著正相关，其中与人参皂苷Rd的相关性最高（ρ = 0.62, p < 0.001）；叶中Cladosporium的相对丰度也与包括Rd在内的多种皂苷含量正相关，且与Rd的相关性同样最高（ρ = 0.69, p < 0.001）。
3.2. 关键真菌内生菌展现出特异的人参皂苷转化能力
从三七组织中成功分离出代表菌株，经形态学和ITS系统发育树鉴定分别为Plectosphaerella niemeijerarum（Plec）和Cladosporium crousii（Clad）。共培养实验证实，这两株菌均能显著降低培养基中人参皂苷Rb1的含量，同时增加Rd的含量，表明它们具备将Rb1转化为Rd的能力。其中，Clad菌株的转化效率高于Plec菌株。随后的β-葡萄糖苷酶活性测定显示，两株菌的培养液上清均能水解pNPG底物，且Clad的酶活性高于Plec，这与转化效率的结果一致。
3.3. 两株关键真菌菌株的基因组组装与系统发育
对Plec和Clad菌株进行全基因组测序和组装，分别获得了36 Mb（36个支架）和33.5 Mb（51个支架）的基因组。Plec和Clad的基因数量分别为12,218和10,583个，功能注释率分别达到92.9%和90.8%。基于单拷贝直系同源基因构建的系统发育树表明，Plec菌株与P. plurivora等亲缘关系较近，而Clad菌株则与C. velox等聚为一支。
3.4. 鉴定可能与皂苷转化能力相关的GH3基因
聚焦于已知可水解Rb1糖基的β-葡萄糖苷酶，特别是糖苷水解酶家族3（GH3）。系统发育分析展示了两个菌株GH3序列与已报道的Rb1转化微生物参考序列间的进化关系。转录组分析发现，在纤维二糖（一种β-葡萄糖苷酶底物）诱导下，Plec和Clad分别有11个和5个GH3基因显著上调表达，这些基因是编码负责Rb1向Rd初始转化的β-葡萄糖苷酶的强候选基因。
3.5. 跨膜运输和环境响应基因家族在两个关键真菌菌株中显著扩张
基因家族进化分析显示，与各自分类学上的近亲相比，Plec和Clad菌株均有特定的基因家族发生了显著扩张。对这些扩张家族的基因本体（GO）富集分析表明，它们与跨膜运输、对各种激素的响应以及线粒体、膜、液泡等细胞组分密切相关。此外，Clad菌株中还显著富集了水解酶活性相关条目。这些结果提示，增强跨膜运输和环境响应能力的基因组扩张，可能是这些真菌适应策略和发挥关键类群作用的基石。
3.6. 两个关键真菌菌株富含次级代谢基因簇和分泌组编码基因
基因组分析进一步揭示，两个关键菌株都拥有丰富的次级代谢物生物合成基因簇（BGCs），其数量在其各自属内处于典型水平。分泌蛋白质组预测在两菌株中均鉴定出大量含有信号肽的分泌蛋白。对这些分泌蛋白的GO富集分析显示，与碳水化合物/多糖代谢、细胞壁组织以及糖苷水解酶活性相关的功能显著富集。这些基因组特征暗示，次级代谢物和分泌蛋白质组（特别是参与碳水化合物修饰的酶）对于这些关键真菌与植物宿主的相互作用至关重要。
研究结论与重要意义
本研究成功地将生态网络分析、微生物培养验证与多组学（基因组、转录组）技术相结合，系统揭示了人参属植物内生真菌群落中的关键类群及其功能。研究不仅识别出根中的Plectosphaerella（Plec）和叶中的Cladosporium（Clad）为关键真菌，更重要的是通过实验证实它们具备将主要人参皂苷Rb1生物转化为Rd的能力，且该能力与β-葡萄糖苷酶活性相关。全基因组与比较基因组学分析为理解其关键类群地位提供了机制性见解：两菌株拥有多个可能参与皂苷转化的GH3家族β-葡萄糖苷酶编码基因（部分受底物诱导上调）；其基因组在跨膜运输和环境响应相关基因家族上发生扩张，增强了适应与交互能力；同时，它们编码了丰富的次级代谢物基因簇和分泌蛋白（特别是糖苷水解酶），这些都可能通过产生抗菌化合物或修饰宿主化学环境来影响微生物群落。
这项研究的核心意义在于，它首次将人参属植物内生真菌中的“关键类群”与其转化宿主特化代谢物（人参皂苷）的具体功能直接联系起来，并初步阐明了其基因组基础。这为“关键类群”通过修饰微环境（如转化化学防御物质）来维持群落稳态和发挥生态功能的假说提供了有力证据。从应用角度看，该工作鉴定出的功能明确的Plec和Clad菌株，是开发用于稀有高价值人参皂苷（如Rd）生物制造的绿色催化剂的宝贵资源。此外，研究所展示的“从网络识别到功能验证再到机制解析”的综合研究范式，为未来在复杂微生物群落中定向挖掘和利用其他功能性关键微生物提供了可借鉴的路线图。
