《Plant Physiology and Biochemistry》：Identification of Candidate Genes Associated with Albino Phenotype in ‘Huangjinya’ tea Plant through Genome Resequencing
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为解决光敏白化茶树分子机制不明的问题，本研究通过BSA-Seq技术筛选出与‘黄金芽’白化表型相关的两个PPR蛋白家族候选基因CsPPR1/CsPPR2。克隆与表达分析揭示了基因序列与表达量差异，VIGS沉默和瞬时过表达功能验证证实了它们调控叶绿素合成与叶色形成的关键作用。该研究为深入解析茶树白化机制及白化茶品种选育提供了重要的理论依据与基因靶点。
“黄金芽”，一种独特的光敏白化茶树种质资源，因其新梢色泽金黄、氨基酸含量高、茶多酚含量低，不仅制茶滋味鲜爽，还具有极高的观赏价值，成为近年来茶产业中的明星品种。然而，其叶色白化的分子机制一直不甚明晰，这在一定程度上制约了其品质稳定性的提升与优良品种的定向选育。面对市场上对白化茶日益增长的需求，揭示其背后的遗传密码，变得至关重要。
以往的研究表明，植物叶色变异往往与叶绿体发育、色素生物合成及相关基因表达调控紧密相关。其中，五肽重复序列(Pentatricopeptide Repeat, PPR)蛋白家族在其中扮演着关键角色。PPR蛋白是维管植物中最大的蛋白家族之一，其核心功能涉及细胞器基因的转录后加工，包括RNA剪接、编辑、稳定及翻译调控等。在拟南芥、水稻、棉花等多种植物中，PPR蛋白的功能缺陷已被证实会直接影响叶绿体发育和叶绿素合成，导致叶片出现白化或黄化表型。那么，在‘黄金芽’茶树中，是否也存在类似的PPR基因主导着其迷人的金黄色表型呢？
为了回答这一问题，来自贵州大学茶学院的研究团队展开了一项系统的研究。他们利用‘黄金芽’及其杂交F1代分离群体，结合前沿的分子生物学技术，成功鉴定出两个与白化表型密切相关的候选基因，并对其功能进行了验证。相关研究成果已发表于植物科学领域知名期刊《Plant Physiology and Biochemistry》上。
研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术方法：
- 1.
群体构建与性状调查：以‘黄金芽’为母本，‘福鼎大白茶’为父本进行人工杂交，获得F1代分离群体，并统计叶色（绿色与白化）分离比。
- 2.
混池分离分析测序(BSA-Seq)：分别提取F1代中极端白化与极端绿色单株的DNA，构建混池进行全基因组重测序，基于SNP-index分析定位与白化性状相关的基因组区域。
- 3.
候选基因克隆与序列分析：从定位区间内筛选候选基因，克隆其在‘黄金芽’和‘福鼎大白茶’中的编码序列(CDS)，并进行氨基酸序列比对分析。
- 4.
基因表达量分析(qRT-PCR)：定量检测候选基因在F1代绿色/白化单株以及亲本叶片中的相对表达水平。
- 5.
基因功能验证：
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病毒诱导的基因沉默(VIGS)：在‘福鼎大白茶’枝条中沉默候选基因，观察表型并测定叶绿素含量变化。
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瞬时过表达：在‘黄金芽’叶片中瞬时过表达候选基因，测定叶绿素含量变化。
研究结果
1. 生理生化与细胞学特征
研究表明，‘黄金芽’叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及类胡萝卜素含量均显著低于‘福鼎大白茶’，净光合速率也明显降低。电镜观察发现，‘黄金芽’的叶绿体缺乏类囊体膜，仅有密集堆积的基粒。在F1代中，白化突变体叶片同样呈现色素含量显著降低、叶绿体结构异常（类囊体系统不完整、出现空泡化）的特征。这些结果表明，叶绿体发育受阻和光合色素合成不足是‘黄金芽’及其白化后代表现出白化表型的细胞学与生理基础。
2. BSA-Seq定位与候选基因鉴定
通过对极端表型混池的测序数据进行SNP-index分析，研究团队在茶树第8号染色体上定位到一个与白化性状显著相关的基因组区域。对该区域内基因进行功能注释后，筛选出两个编码PPR蛋白的基因作为候选基因，分别命名为CsPPR1 (CSS0022601) 和 CsPPR2 (CSS0035494)。
3. 基因序列与表达模式分析
克隆与序列比对发现，与‘福鼎大白茶’相比，‘黄金芽’中CsPPR1和CsPPR2的编码序列存在差异，导致其编码的氨基酸序列发生改变。在F1代白化突变体中，CsPPR1蛋白发生了P136S和K753N氨基酸替换。qRT-PCR结果显示，CsPPR1和CsPPR2在F1代绿色植株中的表达量显著高于白化植株，在‘福鼎大白茶’中的表达量也显著高于‘黄金芽’。这种表达模式的差异暗示这两个基因可能与叶色调控相关。
4. 基因功能验证
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VIGS沉默验证：在‘福鼎大白茶’中分别沉默CsPPR1或CsPPR2基因后，植株新梢出现了明显的光漂白（白化）症状。同时，沉默植株的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均显著下降。这直接证明CsPPR1和CsPPR2的功能缺失会导致叶片白化。
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瞬时过表达验证：在‘黄金芽’叶片中瞬时过表达CsPPR1或CsPPR2基因，能够显著提高叶片中的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。这从反面证实了这两个基因对叶绿素合成的正向调控作用。
研究结论与意义
本研究通过整合BSA-Seq定位、基因克隆、表达分析和功能验证等多种技术手段，最终确定CsPPR1和CsPPR2是参与‘黄金芽’茶树白化表型形成的关键候选基因。其主要结论如下：
- 1.
‘黄金芽’的白化表型与其叶绿体结构发育缺陷、光合色素含量降低以及光合能力减弱密切相关。
- 2.
位于茶树第8号染色体的CsPPR1和CsPPR2基因，其序列变异和低表达水平与白化性状相关联。
- 3.
功能实验证实，抑制CsPPR1或CsPPR2的表达会导致叶片白化和叶绿素减少，而过表达这两个基因则能增加‘黄金芽’的叶绿素含量。这表明CsPPR1和CsPPR2正向调控叶绿素的生物合成，其功能缺失是导致白化表型的重要原因之一。
这项研究的意义在于：
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理论意义：首次将PPR蛋白家族基因CsPPR1/CsPPR2与‘黄金芽’茶树的叶色白化性状直接关联，丰富了人们对茶树乃至植物叶色白化分子机制的理解，特别是PPR蛋白在茶树质体基因表达调控和叶绿体发育中的作用。
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应用价值：为‘黄金芽’等白化茶品种的分子标记辅助选择(MAS)育种提供了直接的基因靶点。通过检测CsPPR1/CsPPR2的基因型或表达量，可以早期、快速鉴定具有理想白化性状的植株，加速育种进程。同时，研究结果也为通过基因工程手段改良茶树叶色、培育兼具高观赏价值与优良品质的新品种提供了理论依据和关键基因资源。
总之，这项研究不仅解开了一部分关于‘黄金芽’迷人金色的遗传之谜，也为未来白化茶产业的品种改良与可持续发展奠定了重要的科学基础。
