《Cancer Research Communications》：ROME expression increases cell motility and chemotaxis in vitro...
Open Access
编辑推荐：
本文报道了一项突破性研究，首次在脊椎动物中详细表征了ROME（INAFM2）蛋白的分子特征及其生化与生物学功能。通过体内CRISPR/Cas9全基因组转录激活筛选，研究发现ROME是尤文肉瘤及其他癌症的强效转移驱动因子。该研究解析了ROME的亚细胞定位、翻译后修饰及其与经典Wnt通路抑制剂的直接互作机制，并通过斑马鱼和小鼠模型证实了ROME在调节癌细胞运动、侵袭和转移中的关键作用。此外，研究还揭示了ROME在脊椎动物正常发育中的必要性，为理解癌症转移和胚胎发育提供了新的分子靶点和机制见解。
ROME：一个调控肿瘤转移与正常发育的脊椎动物膜蛋白的首次功能鉴定
一个基因组范围的CRISPR/Cas9转录激活筛选鉴定出ROME是尤文肉瘤的转移驱动因子
尽管癌症治疗已取得诸多进展，转移仍是导致死亡的主要原因，超过90%的癌症相关死亡归因于此。尤文肉瘤是儿童和青少年中第二常见的骨与软组织肿瘤，其转移性疾病患者的5年生存率低于25%，且缺乏有效的针对性疗法。为了鉴定尤文肉瘤中新的促转移基因，研究团队在斑马鱼体内模型中进行了全基因组CRISPR/Cas9转录激活筛选。斑马鱼是研究人类癌细胞体内侵袭潜力的成熟模型，在该模型中，从注射位点（卵黄囊）主动内渗至鱼尾的细胞被定义为转移样表型。通过优化细胞系和注射条件，团队选择了TC-71细胞系在注射后第二天进行筛选，并首先验证了模型的有效性：过表达已知转移调控因子TWIST1能显著增加细胞在鱼尾的出现率。
随后，研究团队在稳定表达dCas9-VP64（一种转录激活因子融合的催化失活核酸酶）的TC-71细胞中，转导了靶向18，885个基因的gRNA文库，并将细胞注射入斑马鱼卵黄囊。注射后，在gRNA文库组中有12.6%的鱼在尾部检测到人癌细胞，而阴性对照组仅为4.3%。从239条发生转移的鱼尾中收集人癌细胞，提取DNA并扩增gRNA序列进行测序，共检测到812个不同的基因。其中包含已知的转移驱动基因，验证了筛选的可靠性。研究团队从中选择了八个基因进行进一步验证，包括CD68、CXCL8、ELMO2、ROME、KCTD20、KDR、RAB9A和REL。选择标准基于现有文献中的潜在癌症转移作用、gRNA序列的丰度、与患者生存曲线的负相关性，以及在低EWS::FLI1（高转移性）细胞中的上调情况。通过划痕实验和斑马鱼异种移植实验评估，ROME的过表达在TC-71细胞中产生了最显著且一致的迁移和侵袭增强表型，且在筛选中具有最高的读数丰度，因此被选为深入研究的对象。基于其生物学功能，研究团队建议将脊椎动物的INAFM2基因及其蛋白产物命名为ROME（转移调控因子）。
人类ROME基因编码一个单外显子转录本，产生经翻译后修饰的153个氨基酸跨膜蛋白
为了表征ROME的表达和功能，研究团队首先开发了针对人ROME蛋白胞内结构域（ICD）和胞外结构域（ECD）的两种小鼠单克隆抗体，并通过免疫印迹、免疫沉淀和表面等离子共振（SPR）验证了其特异性和结合亲和力。同时，利用CRISPR/Cas9系统在TC-71和CHLA-10细胞系中构建了ROME敲除（KO）克隆。
人类ROME基因编码一个预测为153个氨基酸的跨膜蛋白。拓扑学分析表明，其N端前35个氨基酸位于胞内，随后是一个21个氨基酸的跨膜结构域，以及C端剩余的97个氨基酸构成的胞外域。AlphaFold预测的三维结构显示，跨膜域外的结构主要为内在无序区域。ROME的跨膜结构域与果蝇inaF基序具有显著同源性，且在整个脊椎动物中高度保守。
通过表达eGFP标记的ROME构建体，发现ROME-eGFP主要定位于细胞膜。对过表达ROME-HA的细胞进行分步分离，证实ROME主要存在于膜组分中，但也在可溶性核组分中被检测到。在野生型TC-71细胞的内源性蛋白检测中，也观察到了膜和核组分的分布，但在ROME-KO细胞中则无信号。因此，人ROME蛋白优先定位于细胞膜，但也可能存在于细胞核中。
通过生物信息学分析，预测ROME有10个磷酸化位点和12个糖基化位点。对稳定表达FLAG标签ROME的细胞裂解物进行去糖基化处理，免疫印迹显示ROME-FLAG蛋白的分子量显著降低，证实其在哺乳动物细胞中发生糖基化。进一步通过质谱（MS）分析，确认了ROME在N81位点发生N-糖基化，在S127和S152位点发生磷酸化。值得注意的是，在细菌中表达的重组ROME蛋白也显示出更高的分子量，质谱分析同样检测到N81和N97位点的糖基化，表明其糖基化模式在人和细菌系统中可能存在差异。总之，ROME蛋白主要定位于细胞膜，经历包括磷酸化和N-糖基化在内的多种翻译后修饰。
ROME在斑马鱼和小鼠胚胎中表达，对正常发育至关重要
鉴于ROME在脊椎动物中高度保守，研究团队首先通过原位杂交（ISH）评估了其在斑马鱼胚胎中的表达。在24至36小时受精后（hpf），在Rohan胡须神经元、侧线神经节和嗅基板中观察到最高的rome表达。单细胞RNA测序数据库（Daniocell）的分析也支持其在嗅觉和神经元簇中的表达。
为了探究rome对斑马鱼正常发育是否必需，研究团队使用了翻译阻断型rome吗啉寡核苷酸（MO）。Rome敲低导致了严重的发育缺陷，包括心包水肿、尾部弯曲、严重的头尾部坏死、无明确器官定位的细胞团块形成、头部或尾部缺失以及轴延伸缺陷等。表型严重程度和死亡率与MO剂量呈正相关。通过共注射rome mRNA，可以显著挽救MO注射导致的胚胎死亡率，证明了MO的靶向特异性。此外，使用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼胚胎中的rome基因，也导致了类似的严重发育缺陷。这些结果表明，rome表达对斑马鱼胚胎正常发育至关重要。
为了在哺乳动物发育背景下研究ROME，团队通过RNAscope分析了小鼠胚胎从E10.5到E18.5的Rome表达。在早期阶段（E10.5–E13.5），Rome mRNA在所有组织中普遍表达。在后期阶段，主要表达部位是肝脏中的造血细胞和肠道黏膜下层。通过抗CD61（整合素β3）的免疫组化（IHC）染色，确认了肝脏中Rome阳性细胞具有巨核细胞/髓系特征。此外，通过免疫沉淀和免疫印迹检测了成年小鼠各器官中的ROME蛋白表达，发现在大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺和骨骼肌中均有表达，但表达模式在不同组织间存在显著差异，提示其翻译后修饰和功能状态可能具有组织特异性。综上所述，ROME在斑马鱼和小鼠胚胎及成体中均有表达，敲低或敲除后导致的高缺陷率表明ROME蛋白在正常发育中可能具有关键功能。
Rome在斑马鱼胚胎中调控的发育通路
为了在分子水平上理解rome在斑马鱼发育中的作用，研究团队对注射了对照MO和rome MO的斑马鱼胚胎（48 hpf）进行了单细胞解离和RNA测序。经过质量控制，分析了20，392个对照MO细胞和26，893个rome MO细胞，共鉴定出49个不同的细胞簇。通过自适应阈值低秩近似法（ALRA）估算rome的表达，发现其最高表达于许多神经元簇（如鳃神经上皮/神经元、颅神经节、脊髓中间神经元、视网膜分化神经元2、神经元1/2簇）以及离子细胞中。
通过比较两组细胞，识别出在rome MO条件下显著上调和下调的基因集。通路富集分析显示，上调基因与Wnt信号通路、细胞迁移的正向调控、细胞外基质组织、血管生成、轴突引导和Notch信号通路显著相关。下调基因则与肌肉系统过程、细胞分化、RNA代谢过程和DNA损伤应答相关。这些发现提示，rome的缺失可能扰乱了多个关键的发育信号通路和细胞过程。通过计算每个细胞簇中上调和下调基因的模块评分，发现rome MO处理在多个神经元簇（如脊髓中间神经元、颅神经节、视网膜分化神经元）中引起了最显著的转录变化，这与ALRA估算的高表达区域一致。此外，细胞比例分析显示，在rome MO处理的胚胎中，几个神经元簇（如脊髓中间神经元、视网膜分化神经元2、神经元2）的比例显著降低，而某些间充质/基质细胞簇的比例增加。这可能是由于细胞命运决定的改变或特定细胞类型的缺失所致。
ROME通过直接结合β-catenin负向调控经典Wnt通路
由于在斑马鱼单细胞测序中发现Wnt信号通路显著富集，且之前有报道称经典Wnt通路异常激活可导致斑马鱼胚胎的严重发育缺陷，研究团队推测ROME可能通过调控Wnt/β-catenin通路来影响发育和转移。在TC-71细胞中过表达ROME并使用TOPFlash荧光素酶报告基因检测，发现ROME显著抑制了Wnt3a刺激诱导的Wnt/β-catenin通路活性。同样，在A4573细胞中稳定过表达ROME也抑制了基础水平的Wnt通路活性。相反，在TC-71细胞中敲除ROME，则导致基础水平和Wnt3a刺激下的通路活性均显著增加。
为了探究其机制，研究团队进行了免疫共沉淀（Co-IP）实验。在过表达ROME-HA的TC-71细胞中，内源性β-catenin被共沉淀。在反向Co-IP中，使用β-catenin抗体也能从过表达ROME-HA的细胞中沉淀出ROME-HA。更重要的是，在TC-71野生型细胞中，使用ROME抗体（ICD-6）进行的Co-IP也能沉淀出内源性的β-catenin，而在ROME-KO细胞中则无法沉淀，证明了内源性ROME与β-catenin之间的直接相互作用。表面等离子共振（SPR）实验进一步量化了重组ROME全长蛋白与β-catenin之间的直接结合，亲和力（KD）约为0.5 μmol/L。
为了验证斑马鱼发育缺陷是否由Wnt/β-catenin通路过度激活介导，研究团队进行了表型拯救实验。向rome MO注射的斑马鱼胚胎中共注射ICG-001（一种特异性阻断β-catenin与转录共激活因子CBP结合的Wnt通路抑制剂），可以显著降低由rome MO引起的发育缺陷和死亡率，同时改善特定形态学缺陷。这表明抑制过度激活的Wnt通路可以部分挽救因rome缺失导致的发育表型。因此，ROME通过直接结合β-catenin并抑制经典Wnt通路，在胚胎发育中扮演了重要角色。
ROME的表达调节体外癌细胞运动性和侵袭性
鉴于ROME在筛选和斑马鱼模型中的促转移表型，研究团队在多种细胞模型中评估了其对癌细胞行为的影响。在TC-71细胞中，稳定过表达ROME可显著增强划痕愈合能力和Boyden小室迁移能力，但不影响细胞增殖。相反，敲除ROME则降低了TC-71和CHLA-10细胞的迁移能力。在A4573细胞中瞬时过表达ROME也增强了其迁移能力。这些体外实验一致表明，ROME的表达增强了尤文肉瘤细胞的运动性和侵袭性。
为了探究其分子机制，研究团队在A4573细胞中进行了ROME瞬时过表达的RNA测序。基因集富集分析（GSEA）显示，与细胞外基质组织和细胞粘附相关的基因集显著上调，而与干扰素α反应和干扰素γ反应相关的基因集下调。在TC-71细胞中进行ROME敲除的RNA测序则显示，细胞粘附、细胞外基质组织和上皮-间质转化（EMT）相关的基因集下调。对差异表达基因的进一步分析，鉴定出一个核心基因特征，包括与细胞粘附、迁移和EMT相关的基因（如VIM、ITGB1、LOX）。这表明ROME可能通过调控细胞与基质的相互作用和EMT相关通路来促进侵袭。
值得注意的是，波形蛋白（Vimentin， VIM）是核心差异表达基因之一。通过生物素化邻近标记（BioID2）结合质谱分析，发现ROME与波形蛋白存在潜在相互作用。Co-IP实验证实了ROME-HA与内源性波形蛋白之间的相互作用。SPR实验进一步证实重组ROME全长蛋白与波形蛋白直接结合，亲和力（KD）约为1 μmol/L。此外，在TC-71细胞中敲低波形蛋白表达，可以消除由ROME过表达引起的迁移能力增强，表明ROME的促迁移作用依赖于其与波形蛋白的相互作用。研究还发现，ROME过表达会导致波形蛋白在S56位点的磷酸化水平增加，这可能会影响细胞骨架动力学。
ROME促进斑马鱼和小鼠模型中的体内转移
研究团队在两种不同的体内模型中评估了ROME对转移的影响。首先，在斑马鱼异种移植模型中，与对照相比，稳定过表达ROME的TC-71细胞在注射后第2天和第3天导致转移（细胞出现于尾部）发生率显著增加。相反，在ROME-KO的TC-71细胞中，转移发生率显著降低。通过使用转基因血管荧光斑马鱼品系，观察到在ROME过表达的肿瘤细胞周围，宿主血管密度显著增加，提示ROME可能通过影响肿瘤微环境（如血管生成）来促进癌细胞内渗。
为了在哺乳动物模型中验证，研究团队使用了免疫缺陷小鼠。在尾静脉注射模型中，注射过表达ROME的TC-71细胞的小鼠，在注射后25-26天即出现肉眼可见的肺转移结节，而对照组小鼠则无。对肺部结节的称重和H&E染色分析证实了转移瘤的存在。相反，注射ROME-KO TC-71细胞的小鼠，在注射后28-29天肺部转移负担显著低于注射野生型细胞的小鼠。此外，在胫骨原位注射联合截肢的模型中，过表达ROME显著增加了局部复发和肺转移的发生率，而敲除ROME则降低了转移发生率。这些数据共同证明，ROME在斑马鱼和小鼠模型中都能显著促进尤文肉瘤细胞的体内转移。
ROME表达与多种人类癌症患者的不良生存相关
最后，研究团队利用公共癌症基因组数据集，分析了ROME mRNA表达与患者预后的关系。在尤文肉瘤中，高ROME表达与显著较短的总生存期和无事件生存期相关。这种相关性在其他多种癌症类型中也得到验证，包括肾上腺皮质癌、脑低级别胶质瘤、肾嫌色细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、胰腺癌和肉瘤等。这表明ROME的高表达可能是多种癌症类型中一个共同的、与不良预后相关的生物标志物。
结论
这项研究首次在脊椎动物中报道了ROME（INAFM2）基因编码一种具有生物活性的质膜糖蛋白，并对其进行了详细的分子和功能表征。通过体内筛选发现ROME是癌症转移的关键驱动因子。它定位于细胞膜，经历磷酸化和糖基化修饰，并通过直接结合β-catenin负向调控经典Wnt信号通路，这对于正常胚胎发育至关重要。在癌症中，ROME的表达通过依赖其与波形蛋白的直接互作，增强癌细胞的运动、侵袭和体内转移能力。此外，ROME的高表达与多种人类癌症患者的不良生存率相关。这些发现不仅揭示了一个在发育和疾病中具有重要功能的新蛋白，也为针对转移过程的新治疗策略提供了潜在靶点。
