基于邻近效应激活的CRISPR纳米机器，用于癌细胞的分子特性分析

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Proximity-Activated CRISPR nanomachine for Molecular Characterization of Cancer Cells

【字体：大中小】 时间：2026年03月10日 来源：Sensors and Actuators B: Chemical 7.7

编辑推荐：

　　CRISPR纳米机器通过双靶点检测提高乳腺癌细胞电化学检测敏感性和特异性，检测限达2 cells/mL，适用于临床个性化治疗决策。

李丽娟|刘文胜|王子岩|周国章|毛慧如|高逸楠|曹雅|赵静

上海工程修复研究中心分子识别与生物传感中心，生物材料与生物技术在器官修复领域的国际联合研究实验室（教育部资助），上海大学生命科学学院，中国上海200444

摘要

CRISPR-Cas系统的高效率和特异性使其在生物传感工程中得到广泛应用，CRISPR纳米机器作为先进的分子诊断平台具有出色的性能。本研究开发了一种基于邻近效应激活的CRISPR纳米机器，通过同时识别两个潜在的治疗靶点来分析癌细胞的蛋白质表达模式。选择EGFR和Trop2作为代表性膜蛋白，利用适配体探针（P1和P2）特异性结合这些目标蛋白，并通过与crRNA的邻近诱导杂交触发Cas12a的切割活性。这种激活导致甲基蓝标记的信号探针被切割，产生放大的电化学信号。电化学分析显示该方法具有高灵敏度，检测限为2个细胞/毫升，并且在识别同时表达这两种蛋白的细胞时表现出优异的特异性，即使在Peripheral Blood Mononuclear Cell（外周血单核细胞）样本中也能实现98%以上的回收率。通过替换适配体结构域，该CRISPR纳米机器还展示了其多功能性，能够监测联合治疗的增强效果。因此，这种方法有望准确表征癌细胞，为联合治疗的临床决策提供关键信息。

引言

CRISPR-Cas系统由规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）和相关Cas蛋白组成，最初是原核生物中的一种适应性免疫机制，用于选择性地降解入侵的核酸以抵御外来遗传元素[1]、[2]、[3]。当目标核酸与CRISPR衍生的RNA（crRNA）杂交时，该系统被激活，从而引发对核酸底物的序列特异性切割[4]。由于其高效率和精确的DNA识别及切割能力，基于CRISPR-Cas系统的纳米机器（称为CRISPR纳米机器）已成为基因组编辑和分子诊断的强大工具[5]、[6]。其中，II类CRISPR-Cas系统依赖单个Cas效应蛋白来执行核酸酶活性，在生物分子的敏感检测方面受到越来越多的关注[7]、[8]。例如，CRISPR-Cas9在crRNA和tracrRNA的引导下能够选择性地切割双链DNA[9]；CRISPR-Cas12能够识别特定的DNA靶点并介导目标DNA的切割以及非目标单链DNA的切割[10]、[11]；CRISPR-Cas13作为RNA引导的核酶，能够精确降解RNA分子[12]、[13]；CRISPR-Cas14由于对碱基错配的容忍度低而具有更高的特异性[14]、[15]。特别是CRISPR-Cas12a在生物分析中被广泛用于信号放大，因为它在温和的反应条件下被crRNA互补的目标DNA激活后，能对周围的单链DNA探针产生强烈的切割活性[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。

临床上，癌症对人类健康构成重大威胁，是全球主要的死亡原因之一[21]、[22]、[23]。然而，肿瘤的异质性给有效癌症管理带来了挑战，需要根据个体肿瘤的分子特征制定精确的治疗方案[24]、[25]、[26]。以乳腺癌为例，根据基因表达谱和分子特征，它可以被分为至少四种亚型[27]、[28]、[29]。其中，人表皮生长因子受体-2（HER2）阳性的乳腺癌被认为是最具侵袭性的亚型，与不良预后和远处转移风险增加密切相关[30]、[31]、[32]、[33]。近十年来，针对HER2的疗法显著提高了患者的生存率，但由于治疗耐药性和内在的异质性，许多患者仍不可避免地出现复发和死亡[34]、[35]。因此，迫切需要精确的分子谱分析来更好地表征肿瘤特征，并为乳腺癌患者识别额外的治疗靶点，以实现超越现有策略的个性化治疗。

为了更深入地了解乳腺癌的分子特征，我们开发了一种基于邻近效应激活的CRISPR纳米机器，通过同时识别两个潜在的治疗靶点来分析癌细胞的蛋白质特征[36]。在该设计中，利用CRISPR-Cas12a的切割活性来放大电化学信号，从而能够敏感地检测具有所需分子特征的乳腺癌细胞。与传统方法相比，这种CRISPR纳米机器具有以下优势：（1）通过CRISPR-Cas12a的切割活性实现高效信号放大，显著提高目标细胞的检测灵敏度；（2）双重识别提高了特异性，特别是在复杂样本中减少了假阳性信号；（3）得益于电化学技术的整合，具有出色的定量能力和较低的分析成本[37]、[38]、[39]、[40]。图1展示了用于乳腺癌细胞分子表征的邻近效应激活CRISPR纳米机器的原理。以HER2阳性的BT-474乳腺癌细胞为模型，选择表皮生长因子受体（EGFR）和滋养层细胞表面抗原2（Trop2）作为代表性膜蛋白，这两种蛋白都与乳腺癌的肿瘤生长、转移和药物耐药性有关[41]、[42]。为了实现共表达膜蛋白的双重识别，设计了两种适配体探针（P1和P2）。每个探针包含一个与crRNA部分互补的激活结构域（H1或H2），以及一个特异性结合相应目标蛋白的适配体结构域（Apt-EGFR或Apt-Trop2）。这两种探针可以锚定在同时表达EGFR和Trop2的乳腺癌细胞表面（如BT-474细胞），使各自的激活结构域（H1和H2）与crRNA杂交，从而激活CRISPR-Cas12a的切割活性。结果，甲基蓝（MB）标记的信号探针被非特异性切割，释放出带负电荷降低的MB分子，在氧化铟锡（ITO）电极上产生放大的电化学信号。因此，通过追踪表面富集的MB分子信号来实现目标细胞的电化学检测。

部分内容摘录

化学物质和材料

PE标记的抗EGFR抗体、PE标记的抗Trop2抗体和PE标记的抗HER2抗体购自BioLegend。胎牛血清（FBS）、L-1640培养基和L-15培养基购自Gibco有限公司。Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞活力测定试剂和DAPI染色液购自Sangon Biotech（上海）有限公司。吉非替尼和Bruceine D购自北京Solarbio科技有限公司。重组Cas12a蛋白购自

不同细胞的蛋白质特征分析

首先评估了包括BT-474、MDA-MB-453和MCF-10A在内的多种细胞系的蛋白质特征。首先使用流式细胞术级别的抗体来特异性识别并结合表面蛋白（图1A）。在BT-474细胞中，当结合荧光标记的EGFR或Trop2抗体时观察到明显的荧光变化。相比之下，在MDA-MB-453细胞中，只有在结合荧光标记的Trop2抗体后才观察到明显的荧光变化

结论

总之，我们开发了一种基于邻近效应激活的CRISPR纳米机器，用于精确识别乳腺癌细胞的分子特征，实现基于双重靶点的电化学检测。通过利用CRISPR-Cas12a的切割活性（仅在两种适配体探针同时锚定在同一细胞表面时被激活），该纳米机器对BT-474细胞的检测具有高灵敏度，检测限为2个细胞/毫升。

CRediT作者贡献声明

赵静：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念设计。曹雅：撰写 – 审稿与编辑，监督，方法学。高逸楠：撰写 – 审稿与编辑。毛慧如：实验研究。周国章：实验研究。王子岩：方法学，实验研究。刘文胜：方法学，实验研究。李丽娟：撰写 – 初稿，方法学，实验研究。