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本研究开发了一种基于指数环状扩增（ERCA）与侧流层析试纸（LFA）联用的快速高灵敏度核酸检测平台，用于癌症生物标志物筛查。通过优化模板设计和反应参数，扩增时间缩短至6分钟内，检测限达4 aM，全流程10分钟完成且无需专业设备，适用于现场快速诊断。
滕宇茹|黄宇芬|吴善荣|黄彦杰|叶欣瑜|卢传春|李成宇
台湾桃园市中原基督教大学化学系
摘要
本研究报道了一种结构优化的指数滚环扩增（ERCA）-侧向流动分析（LFA）平台，该平台能够实现超快且超灵敏的核酸检测，适用于癌症生物标志物的诊断。通过设计具有多个策略性定位的Nb.BbvCI切割位点的环形模板，并系统优化关键反应参数（包括酶浓度和模板设计），扩增时间显著缩短至6分钟以内，同时保持了灵敏度。以miR-141（一种结直肠癌生物标志物）作为模型目标，该检测方法的检测限达到4 aM，动态范围为10 aM至100 nM。扩增产物与侧向流动条上的双标记探针杂交，产生肉眼可见的红色测试线。整个检测过程（从扩增到可视化读数）在等温条件下仅需10分钟，且无需特殊仪器或受过培训的人员。该平台在含有干扰性miRNAs的人尿液中也表现出强大的选择性。由于其模块化的探针设计，该系统可轻松适应多种核酸目标，为早期癌症筛查和即时诊断提供了一种快速、灵敏且可现场应用的解决方案。
引言
侧向流动分析（LFA）是一种广泛使用的基于纸张的生化传感技术，它利用毛细作用驱动液体样本沿测试条移动，从而实现目标分子的快速直观检测，无需特殊仪器或受过培训的人员。它具有低成本、易于使用和一次性的特点，降低了交叉污染的风险，同时提供快速可靠的结果[1]。自从第一个基于尿液的妊娠测试成功商业化以来，LFA已广泛应用于食品安全、临床诊断和环境监测等多个领域[2]、[3]、[4]、[5]。传统的LFA通常使用抗体作为生物识别元件[6]、[7]，依靠其高特异性来识别目标并生成视觉信号。然而，对于低丰度分析物，抗体的灵敏度不足可能导致假阴性[1]。此外，与非目标分子的结构相似性以及复杂的样本基质可能会引起假阳性[8]，而稀释样本以减少干扰会进一步降低灵敏度。这些限制降低了LFA对低浓度目标的可靠性。因此，迫切需要开发更灵敏和更快速的检测策略。近年来，提出了多种信号放大策略来提高LFA的检测灵敏度。在纳米材料方面，荧光纳米颗粒[9]、[10]和表面修饰技术[4]等方法可以通过改变光学性质或增加信号标签的比表面积来增强检测信号。然而，纳米材料容易受到背景噪声和非特异性吸附的影响，可能导致假阳性，且其制备和修饰过程通常复杂且成本高昂。除了基于纳米材料的策略外，还探索了核酸扩增技术来提高LFA的灵敏度[11]、[12]。然而，一些扩增方法仅提供有限的灵敏度提升[13]、[14]，而其他方法则依赖外部仪器进行信号读取或需要较长的反应时间[15]、[16]。这些限制削弱了LFA的基本优势，包括快速检测、直接视觉解释以及无需仪器的现场适用性。在保持这些操作优势的同时提高灵敏度具有很高的价值，因为它解决了关键的性能瓶颈，并显著扩展了LFA平台的诊断用途。
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，2020年估计有190万新病例，约占所有癌症病例的10%[17]。在癌症相关死亡率方面，CRC仅次于肺癌[18]、[19]，导致约9.4%的癌症死亡，估计有935,173人死亡[20]。尽管早期诊断显著提高了治愈的机会，但大多数CRC病例在晚期才被诊断出来，错过了最佳治疗窗口，这是整体生存率较低的主要原因之一[21]。目前的CRC临床筛查方法包括免疫化学粪便隐血检测（iFOBT）、肿瘤标志物分析和结肠镜检查。iFOBT通过检测血红蛋白来识别肠道出血；然而，血红蛋白在胃肠道环境中不稳定，痔疮或溃疡等状况也可能导致阳性结果。这常常导致假阳性，使得难以确定出血是否与肿瘤相关[22]。肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA）被广泛用于辅助诊断和监测，但其特异性有限，因为其他癌症或炎症状态也可能导致其水平升高[23]、[24]。虽然结肠镜检查结合活检仍然是诊断的金标准，但其侵入性和并发症风险导致患者依从性较低[25]。因此，迫切需要更安全、更准确、非侵入性的筛查方法。最近的研究表明，微RNA在肿瘤发展中起着关键作用[26]、[27]、[28]。其中，miR-141作为miR-200家族的成员，是结直肠癌的高度指示性生物标志物。它在CRC患者中显著上调，并与肿瘤进展和不良预后密切相关[29]、[30]。此外，在尿液样本中也检测到了微量的miR-141，这突显了其作为CRC非侵入性分子诊断生物标志物的潜力[31]、[32]。LFA特别适合检测miR-141，因为它们简单、读数快速且设备要求低。将LFA集成到miRNA检测中，可以实现CRC生物标志物的分散和及时监测，这对于早期诊断和干预至关重要。此外，LFA具有即时（POC）和家庭检测的潜力，能够频繁、无创地评估癌症相关生物标志物，无需特殊人员或实验室设施。这一能力不仅提高了患者的依从性，还将miRNA-141检测的应用范围扩展到资源有限或偏远地区，从而弥合了实验室研究和实际临床诊断之间的差距。在分子诊断领域，聚合酶链反应（PCR）是一种广泛使用的核酸扩增技术，具有高灵敏度和特异性[33]，但它需要复杂的热循环仪器和受过培训的人员，限制了其在即时（POC）诊断中的适用性。相比之下，滚环扩增（RCA）是一种等温核酸扩增方法，能够在室温下连续高效地复制DNA[34]、[35]。RCA不需要热循环设备，整个过程更简单，使其成为现场快速诊断的理想工具。鉴于其简单性、低设备要求和强大的扩增效率，RCA作为POC检测的实用高效方法具有巨大潜力。
本研究报道了一种将指数滚环扩增（ERCA）与侧向流动分析（LFA）结合的分子诊断平台的开发，使用结直肠癌生物标志物miR-141作为模型目标。这种方法显著提高了灵敏度，能够检测到极低浓度的分子。通过策略性的模板工程和系统的反应优化，扩增时间从1-2小时缩短到不到6分钟，使整个检测过程在10分钟内完成。利用ERCA实现了miR-141的特异性识别和等温扩增，显著提高了低丰度癌症生物标志物的可检测性。为了在保持原子摩尔灵敏度的同时加速信号生成，设计了一种多切割点环形模板，在部分合成阶段触发内切酶辅助的指数扩增，从而缩短了扩增周期。扩增产物随后与标记探针杂交，并通过LFA进行视觉信号输出。在毛细驱动的流动过程中，测试线上产生了可见的比色信号。这种快速扩增和可视化读数的结合不仅保留了LFA的简单性和低成本特性，还大幅提高了其分析性能和临床适用性。这项工作建立了一个适用于POC环境的快速灵敏检测平台。通过优化分子设计和操作参数，该系统实现了对低浓度分析物的稳健检测，所需仪器最少，并增强了侧向流动条在早期癌症筛查和现场诊断中的实际价值。此外，通过简单改变探针序列，该平台可以轻松适应检测多种疾病相关生物标志物。
部分摘录
试剂和材料
T4多核苷酸激酶（10 U/μL）、T4 DNA连接酶（10 U/μL）和Phi29聚合酶（10 U/μL）购自Lucigen（英国）。三磷酸腺苷（100 mM）、外切酶I（20 U/μL）和外切酶III（100 U/μL）购自New England Biolabs（美国）。SYBR? Green I购自Thermo Scientific。dNTPs（25 mM）购自NBS Biologicals。牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma-Aldrich（美国）。去离子水（H2O，18.0 MΩ-cm）使用EASY Pure LF制备ERCA-LFA检测原理
实验设计包括两部分：核酸扩增和侧向流动条检测。如图1所示，设计的环形模板（CT）包含一个miR-141识别区域（用红色表示）和一个Nb.BbvCI识别位点（用绿色表示）。CT仅在系统中存在miR-141时才会与其结合，在phi29聚合酶的催化下启动ERCA反应，生成长的单链DNA产物。随后，支持...
结论
通过引入和优化指数滚环扩增（ERCA），我们显著提高了侧向流动分析（LFA）在miRNA检测中的分析性能。该平台对结直肠癌生物标志物miR-141的检测限达到4 aM，扩增在6分钟内完成，整个检测过程在10分钟内完成，并具有直接视觉读数。通过对环形模板上Nb.BbvCI切割位点的系统优化，加速了信号...
CRediT作者贡献声明
吴善荣：撰写 – 审稿与编辑、可视化、数据整理。黄彦杰：撰写 – 审稿与编辑、验证。叶欣瑜：撰写 – 审稿与编辑、验证。卢传春：撰写 – 审稿与编辑、验证。李成宇：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、方法学、资金获取、概念化。滕宇茹：撰写 – 初始草稿、可视化、验证、项目协调、方法学
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
