TGEV感染通过YY1/HSP40/NF-κB通路激活肠道上皮细胞和类器官中的促炎信号通路

《Veterinary Microbiology》：TGEV infection activates pro?inflammatory signaling via the YY1/HSP40/NF?κB pathway in intestinal epithelial cells and organoids

本研究首次揭示TGEV感染期间猪肠道中热休克蛋白HSP40的高表达及其通过YY1转录因子激活的机制。HSP40通过促进β-TRCP介导的IκB泛素化降解，释放NF-κB p65核转位，增强炎症反应和病毒复制。该发现为靶向HSP40开发抗病毒疗法提供了依据。

郭帅|赵哲|曹宗熙|王峰|孙瑞萍|刘光亮

中国海南省农业科学院三亚研究所海南实验动物研究中心

摘要

传染性胃肠炎病毒（TGEV）是一种猪肠道致病性冠状病毒，可导致猪出现严重的肠道炎症和腹泻，给全球养猪业带来巨大经济损失。炎症是感染TGEV的猪死亡的主要原因之一。然而，宿主介导的炎症反应在TGEV发病机制中的作用仍不明确。本研究首次发现，在Wuzhishan猪感染TGEV期间，热休克蛋白HSP40（DNAJB6）在空肠和回肠中高度表达，并且其转录受到转录因子YY1的调控。功能获得和丧失实验表明，HSP40通过调节NF-κB信号通路增强了炎症反应和TGEV的复制。机制上，HSP40促进了β-TRCP的募集，β-TRCP是一种IκB的E3泛素连接酶，从而增强了其与IκB的相互作用及随后的蛋白酶体降解。在正常情况下，IκB在细胞质中结合并隔离p65（RelA），阻止其核转位和转录活性。在TGEV感染期间，HSP40介导的IκB降解释放了p65，使其能够进入细胞核并激活多种炎症基因的转录。此外，β-TRCP对于HSP40介导的炎症细胞因子的产生至关重要。这些发现揭示了HSP40在TGEV感染期间调节炎症和病毒复制中的关键作用，提示针对HSP40可能是治疗TGEV的有效途径。

引言

仔猪腹泻主要由猪肠道冠状病毒（SECoVs）引起，包括传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）以及新出现的猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）（Duan等人，2022；Zhao等人，2023；Yu等人，2023）。其中，TGEV是仔猪急性胃肠炎的主要致病因子，感染新生猪的死亡率接近100%，对养猪业造成巨大损失。最近的一项研究发现了CCoVHuPn-2018病毒（Tortorici等人，2022），这是一种从马来西亚肺炎患者身上分离出的新型犬猫重组α冠状病毒，其与TGEV刺突结构域B的序列同源性约为90%（Liu等人，2023；Wu等人，2023）。这表明TGEV不仅对猪肉产业构成严重威胁，还可能具有动物源性传染潜力。

TGEV在猪体内引发强烈的炎症反应，导致感染仔猪的高死亡率（Zhang等人，2024）。最新研究阐明了宿主炎症信号通路与TGEV复制之间的复杂相互作用，揭示了免疫激活和病毒免疫逃逸的关键机制（Xue等人，2022）。例如，TGEV感染激活了RIG-I信号通路，导致促炎细胞因子（如IL-6、IL-1β和TNF-α）的表达增加（He等人，2023）。此外，TGEV包膜（E）蛋白与宿主TMED10相互作用，TMED10是一种非传统蛋白质分泌的调节因子（Liu等人，2024；Chen等人，2023）。这种相互作用促进了细胞因子的释放，导致细胞因子风暴和组织损伤。值得注意的是，针对E–TMED10相互作用的小分子抑制剂在减轻过度炎症方面显示出潜力，为TGEV引起的肠炎提供了潜在的治疗途径。

ELF3–TRIM22–MAVS信号轴也参与了针对RNA病毒（包括TGEV）的I型干扰素（IFN）反应（Zhao等人，2025）。TRIM22增强了MAVS的泛素化，促进了IFN的产生并抑制了病毒复制（Zu等人，2022）。然而，TGEV可能通过调节宿主转录程序来对抗这种抗病毒防御，突显了宿主-病毒军备竞赛的动态性质。

HSP40/DnaJ分子伴侣家族在病毒感染和抗病毒防御中起着关键作用（Chen和Li，2024；Purificación等人，2024；Cao等人，2022）。其中，DNAJB6已成为病毒复制、病毒颗粒运输和宿主免疫反应的关键调节因子（Han等人，2020）。根据病毒和细胞环境的不同，DNAJB6可能促进或限制感染（Ko等人，2019；Cheng等人，2008）。例如，在日本脑炎病毒（JEV）感染中，DNAJB6与病毒NS3蛋白结合，减少病毒增殖并可能减轻神经炎症（Cao等人，2019）。相反，HSP40/DnaJ蛋白通过干扰MAVS的激活来负调节RIG-I样受体（RLR）介导的I型IFN的产生（Kim和Hong，2022；Fatima等人，2025；Huang和Li，2025）。虽然这种机制可以防止过度炎症，但病毒也可能利用它来逃避免疫。

在本研究中，我们发现TGEV感染期间HSP40的表达通过YY1的转录激活而上调。机制上，HSP40促进了β-TRCP介导的IκB泛素化和降解，释放p65使其进入细胞核并激活下游炎症基因。重要的是，我们证明HSP40以NF-κB依赖的方式促进TGEV的复制。这些发现将YY1/HSP40（DNAJB6）/NF-κB轴确定为抗TGEV的潜在靶点。

Wuzhishan猪与大白猪之间HSP40表达的差异

本研究旨在确定热休克蛋白（HSPs）是否参与TGEV感染。我们从大白猪和Wuzhishan猪中收集空肠和回肠组织，分析了HSP40和HSP70的表达水平。qRT-PCR分析显示，大白猪的HSP40和HSP70 mRNA水平高于Wuzhishan猪（图1A）。然而，两种品种之间的HSP70蛋白水平没有显著差异（图1B）。

细胞培养和转染

ST细胞（猪睾丸细胞）在含有10%胎牛血清（FBS；HyClone）的DMEM培养基中于37°C、5% CO?条件下培养。定期检测细胞系以确认无支原体污染，并使用Gene Detection Biotechnology（中国苏州）的短串联重复序列标记进行鉴定。

对于转染，当细胞密度达到70–80%时，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）按照制造商的方案进行质粒DNA或siRNA转染。

讨论

本研究揭示了TGEV通过YY1/HSP40/NF-κB信号通路加剧肠道炎症并促进病毒复制的新分子机制。我们发现TGEV感染上调了转录因子YY1，YY1直接结合到HSP40/DNAJB6启动子的?722/?737 nt区域，驱动其转录激活。上调的HSP40作为支架蛋白，促进了E3泛素连接酶β-TRCP与NF-κB抑制剂的相互作用。

结论

总之，我们发现TGEV通过劫持宿主YY1/HSP40/NF-κB通路来放大炎症并增强病毒复制的新机制。这些发现加深了我们对猪冠状病毒发病机制的理解，并强调了靶向HSP40介导的泛素化的治疗潜力。开发特定的HSP40抑制剂或破坏HSP40–β-TRCP相互作用的药物可能成为针对TGEV及相关冠状病毒的双重用途药物。

CRediT作者贡献声明

郭帅：撰写初稿、研究设计、资金获取、概念构思。曹宗熙：验证、资源提供。赵哲：资源提供、项目管理、数据整理。孙瑞萍：验证。王峰：资源提供。刘光亮：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金区域项目（项目编号32460880）和海南省自然科学基金（项目编号324QN343）的支持。