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犬细小病毒（CPV）变异导致疫苗保护力下降，传统支持疗法疗效有限。本研究通过单B细胞测序结合HelixFold-Multimer结构预测，筛选出犬源单抗E9，其在体外抑制病毒活性，体内治疗有效率80%，为开发新型抗病毒生物制剂提供高效策略。
李颖|张晓雨|王志豪|林明钦|王胜|张成光|赵玲|邹家辉|周洪波
中国农业大学生物医学学院农业微生物国家重点实验室，中国湖北省武汉市
摘要
犬细小病毒（CPV）是一种高度传染性和致命性的病原体，对犬类健康构成重大威胁。尽管广泛开展了疫苗接种工作，CPV仍然是导致出血性肠炎和心肌炎的主要原因之一。此外，现有的支持性治疗方法往往效果不佳。因此，我们迫切需要探索替代或补充的治疗策略。在这项研究中，通过将单B细胞测序技术与抗原-抗体结构预测相结合，我们成功筛选出了一种针对CPV的犬源单克隆抗体（mAb）E9。E9在体外表现出高亲和力和广谱中和活性，在体内达到了80%的治疗效果。这一治疗效果凸显了E9作为下一代CPV生物制剂的巨大潜力。总之，我们的研究为获取中和抗体提供了一种更有效的方法，并为对抗CPV提供了有希望的策略。
引言
犬细小病毒（CPV）是一种无包膜的单链DNA病毒，属于细小病毒科（Parvoviridae）的原细小病毒属（Protoparvovirus）（Dema等人，2021年；Shvets等人，2022年）。作为一种高度传染性和致命性的病原体，CPV对犬类健康构成重大威胁（Jiang等人，2021年）。自20世纪70年代末CPV-2首次出现以来，该病毒经历了动态的进化过程（Zhou等人，2024年），产生了包括CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c在内的多种变异株（Chen等人，2019年；Huang和Pu，2020年；Mazzaferro，2020年；Pu等人，2024年）。VP2蛋白第426位的氨基酸突变是区分这些CPV变异株的关键进化标志。具体来说，该位点的氨基酸从原始CPV-2的天冬氨酸（Asp）变为CPV-2a/2b的天冬酰胺（Asn），最终在目前流行的CPV-2c中变为谷氨酸（Glu）（Buonavoglia等人，2001年；Doan等人，2021年；Kwan等人，2021年）。这些变异株具有更强的环境适应性和更广泛的宿主范围（Temizkan和Sevinc Temizkan，2023年）。
虽然疫苗接种仍然是预防和控制CPV的主要方法，但在临床实践中疫苗失败的情况仍然频繁发生（Dall'Ara等人，2023年；Decaro等人，2020年）。这主要是由于母源抗体的干扰和病毒的进化。母源抗体阻止幼犬建立主动免疫反应，导致早期接种失败（Dall'Ara等人，2021年；Kelman等人，2020年）。传统疫苗株与当前流行的变异株（尤其是CPV-2c）在抗原性上存在差异，导致疫苗诱导的中和抗体的交叉保护作用减弱（Doan等人，2021年；Singh等人，2021年）。
CPV感染的临床管理主要依赖于对症治疗，旨在缓解临床症状、纠正脱水和预防继发性细菌感染（Horecka等人，2020年；Iris等人，2010年）。然而，对于症状严重的犬只，依赖对症治疗往往会导致预后不良（Chethan等人，2023年；Dos Santos等人，2023年；Mu?oz等人，2021年；Schmitz，2021年）。CPV中和抗体的应用使得治疗方式从对症治疗转向了靶向抗病毒治疗（Alves等人，2025年）。目前开发或临床使用的大多数CPV治疗抗体来源于小鼠，其固有的免疫原性缺陷限制了其应用（Legouffe等人，1994年；Lu等人，2020年）。在犬体内注射此类异种蛋白质可能会引发严重的免疫排斥反应并加速抗体的清除。因此，迫切需要开发犬源CPV治疗抗体。这类抗体作为安全、低免疫原性的抗病毒剂，具有广谱中和活性，可以克服传统疫苗和异种抗体的局限性。
在治疗抗体的开发中，单B细胞抗体筛选技术已成为抗体发现的首选方法（Pedrioli和Oxenius，2021年）。这是因为该方法具有优势，包括能够获得天然配对的抗体可变区基因，确保抗体结构的天然构象，并直接筛选自体抗体（Laustsen等人，2021年）。在此基础上，结合单细胞测序技术研究B细胞基因表达谱和免疫库信息，可以进一步加速抗体发现过程（Erlach等人，2024年）。抗原-抗体复合物的结合也非常重要。基于深度学习的抗原-抗体结合构象预测模型HelixFold-Multimer通过优化链级信息交换和训练策略实现了抗原-抗体的整合（Fang等人，2024年）。这使得抗原-抗体相互作用的高精度评估成为可能，显著优于以往的方法（Bryant等人，2022年；Fang等人，2023年；Wang等人，2022年；Yin等人，2022年；Yin和Pierce，2024年；Zheng等人，2024年）。单细胞测序技术与HelixFold-Multimer的结合提供了一种强大的、以结构为导向的流程，有效加速了治疗抗体的开发过程。
在这项研究中，我们通过结合单B细胞测序和HelixFold-Multimer分析，成功鉴定出一种广谱中和抗体E9。E9在体外有效抑制CPV感染，并在体内显示出优异的治疗效果。我们的研究结果表明，E9作为治疗CPV的新抗病毒剂具有巨大潜力。
部分摘录
细胞和病毒
HEK293细胞悬浮液由KAIRUI Biotech（中国）提供。F81细胞由华中农业大学的赵玲博士慷慨赠送。F81细胞通常在添加了10%胎牛血清（NEWZERUM，新西兰）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，并在37℃、5% CO2的湿润环境中孵育。HEK293细胞悬浮液在KAIRUI Biotech（中国）提供的KOP 293培养基中培养，并在37℃的摇床培养箱中以5% CO2条件孵育。
序贯接种可诱导针对多种CPV变异株的广谱中和抗体
为了筛选针对CPV的广谱中和抗体，三只犬接受了总共五剂CPV疫苗的序贯免疫（初次-加强）策略。该策略包括三剂CPV-2b活减毒疫苗（LAV），随后是两剂CPV-2c灭活疫苗（IAV）（图1A）。在第三次、第四次和第五次接种后两周收集血清样本，随后检测针对各种CPV亚型的中和抗体滴度
讨论
CPV对犬类健康构成严重威胁，特别是CPV-2c的出现对现有疫苗的有效性提出了挑战（Zhou等人，2024年）。临床对症治疗难以提供可靠的抗病毒保护，这进一步凸显了开发抗病毒生物制剂的迫切需求。治疗抗体由于具有明确的目标、高亲和力和强大的中和活性，已成为治疗的关键策略
结论
总之，我们通过有效整合单细胞测序和结构预测技术，成功筛选出了单克隆抗体E9。E9在体内和体外均被证实能有效抑制CPV感染，显示出作为下一代治疗剂的巨大潜力。
CRediT作者贡献声明
邹家辉：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、项目管理、方法学。赵玲：方法学、实验研究。周洪波：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、项目管理、方法学。李颖：撰写 – 初稿撰写、数据可视化、验证、方法学、实验研究、正式分析。王志豪：数据可视化、方法学、实验研究、数据管理。张晓雨：数据验证、方法学、实验研究、正式分析、数据管理。林明钦：
伦理声明
本研究中的所有动物实验均获得了华中农业大学动物实验伦理委员会的批准。（编号：HZAUDO-2025–0025）
资助
本研究得到了国家重点研发计划（2023YFD1800300）、中央高校基本科研业务费（2662025DKPY009）、湖北洪山实验室（2022hszd005）、西藏农牧学院柔性人才引进项目（00000198）以及CARS-41专项资金的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢农业微生物国家重点实验室核心设施在荧光显微镜/流式细胞术/生物层干涉（BLI）方面的协助。
