《The Veterinary Journal》：Development of a MALDI-TOF nucleic acid mass spectrometry-based assay for the detection of 10 major avian diseases
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禽流感等10种禽类疾病病原体快速检测技术开发成功，采用MALDI-TOF MS结合多PCR-SAP增强检测特异性，灵敏度达4.70-52.54 copies/μL，显著优于传统方法。
赵雅|陈云雷|韩晓|孔鹏丽|宋世琪|邱慧|叶志宏|张晓峰|帅江兵
中国吉利梁大学生命科学学院，杭州310018，中国
摘要
禽流感、新城疫、传染性支气管炎等禽类疾病的暴发对全球家禽产业和公共卫生构成了重大威胁。本研究旨在开发一种快速、高通量的多目标检测方法，用于同时检测禽流感（AIV）、新城疫（NDV）、传染性支气管炎（IBV）、传染性喉气管炎（ILTV）、禽痘（FPV）、禽腺病毒（FAdV）和禽偏肺病毒（AMPV）等常见于禽养殖中的关键病原体。该方法基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术，设计了针对目标病原体AIV（H5/H7/H9）三种亚型以及NDV、IBV、ILTV、FPV、FAdV和AMPV通用类型的特异性多重引物。通过优化多重PCR系统，可以同时扩增病原体的特定基因片段。随后利用SAP反应提高检测特异性，并通过MALDI-TOF MS快速鉴定扩增产物。结果表明，该方法具有优异的灵敏度和特异性，能够区分10种目标病原体。检测限范围为4.70至52.54拷贝/μL，表明该系统具有高灵敏度。在模拟样本测试中，该方法显示出良好的准确性和重复性，与传统方法相比显著缩短了检测时间和成本。本文开发的MALDI-TOF质谱多重检测技术为禽类疾病的快速诊断、预防和控制提供了新的方法，具有重要的实际价值。
引言
禽类疾病对全球养殖业构成了重大挑战，不仅影响其经济效益，还带来潜在的公共卫生和安全风险。常见的禽类疾病包括禽流感（AI）、新城疫（ND）、传染性喉气管炎（ILT）、传染性支气管炎（IB）和禽痘（FP）等。这些病原体传播迅速，临床表现不典型，现有的诊断技术耗时且通量低，使得诊断极其困难。禽流感是最为人所知的禽类疫情之一，尤其是高致病性禽流感（HPAI）病毒，如H5N1和H7N9，它们导致了严重的家禽损失，并存在传播给人类的风险，引发公共卫生和安全问题。近年来，H5N1的一个新变种H5N1（分支2.3.4.4b）在欧洲、美国和亚洲的禽类中爆发，并从禽类传播到多种哺乳动物（Wanyi等人，2025a）。自2024年3月以来，高致病性H5N1禽流感变种（分支2.3.4.4b）在牛群中传播并导致人类感染。根据美国疾病控制与预防中心的最新数据，该病毒已在美国16个州的牛群中被发现，且在多次牛奶样本中检测到感染性病毒（Lifei和Shanni，2025）。NDV与AI一样，是一种由病毒引起的急性呼吸道感染，两者均被列为进口到中华人民共和国的动物检疫疾病名单中的第一类疾病。FPV的黏膜型病变容易与ILTV混淆，因此临床诊断需要依赖分子分型。此外，FAdV和AMPV的免疫抑制作用可能会加剧其他病毒在家禽中的致病性（Esther等人，2008；Tsunekuni等人，2017）。在禽类疾病暴发期间，由于大量家禽被强制扑杀，农场可能会遭受重大经济损失。同时，贸易和出口可能会受到限制，影响社会稳定。因此，建立一种快速、高通量的多目标检测方法至关重要。
近年来，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）已成为分子诊断领域的重要工具，主要用于基因分型（Ren等人，2025）、突变检测（Medical Oncology等人，2018）、微生物鉴定（J等人，2014）和药物基因组学检测（Shujuan等人，2020），因为它具有高通量、快速和灵敏度的优势。MALDI-TOF质谱（Hong等人，2014）通过PCR扩增目标序列并结合碱基特异性消化或延伸反应来检测核酸片段的质量差异，并利用MALDI-TOF质谱实现高精度的单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失和甲基化分析。大约在2000年，研究人员主要关注如何使用MALDI-TOF质谱检测短序列（Banoub等人，2005）。随后Sequenom公司推出的MassARRAY系统（Christian等人，2004）推动了这项技术的临床应用，将其从传统的基因组分析扩展到临床诊断和病毒基因组研究等领域，成为快速筛查病原体和突变位点的重要工具。多重核酸分析技术的出现也使得MALDI-TOF能够在短时间内实现多重病原体检测，且无需大量试剂和复杂操作。该技术在检测结核分枝杆菌（Division of Clinical Microbiology等人，2015）、猪源病毒（Zhiqiang等人，2025）和牛源病毒（Jiangbing等人，2025）等病原微生物方面被证明是准确有效的，为混合感染的鉴定、病原体分型和临床应用提供了更多便利，提高了效率和准确性。
在本研究中，基于MALDI-TOF质谱和多重PCR技术，我们建立了一种多重检测方法，用于同时检测这10种常见禽类病原体，包括AIV的三种亚型H5/H7/H9，以及通用类型的NDV、ILTV、IBV、FPV、FAdV和AMPV，为禽类疾病的早期诊断、预防和控制提供了新的解决方案。
部分摘录
病毒
用于特异性实验的APV（弱毒株）购自武汉科谦生物有限公司；DPV（CVCC AV1222株）购自哈尔滨制药集团生物疫苗有限公司；GPV（SYG41–50）购自国药扬州威克生物工程有限公司；IBD（B87株）、IC（A型）、MD（FC-126株）疫苗样本、FAdV和AMPV保存在我们的实验室中。使用的H5、H9、NDV-1、IBV、ILTV和FAdV菌株的核酸样本
多重系统的建立与优化
系统中的各种病毒在质谱图像中具有两个峰值位置，分别对应于延伸探针和单碱基延伸产物。如果质谱图像在延伸产物处显示峰值且信噪比（SNR）≥6，则表示目标检测结果为阳性；如果峰值仅出现在延伸探针处，则表示目标检测结果为阴性，具体结果见图1
讨论与结论
禽类疾病的流行对养禽业、公共卫生和经济构成严重威胁，尤其是流感病毒，它们是全球大流行的主要威胁。野生鸟类中的低致病性禽流感H5和H7亚型病毒可以突变成高致病性禽流感（HPAI），导致家禽系统性感染，造成极高的死亡率。H5N1亚型的禽流感病毒起源于家禽，并在全球范围内传播
CRediT作者贡献声明
宋世琪：方法学、正式分析。孔鹏丽：撰写 – 审稿与编辑、验证、正式分析。叶志宏：验证、正式分析。邱慧：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、项目管理、资金争取。陈云雷：监督、项目管理。赵雅：撰写 – 原稿撰写、方法学、数据管理。韩晓：撰写 – 审稿与编辑、验证。帅江兵：资源获取、项目管理、调查。张晓峰：
资助
本研究得到了浙江省雁产业领军计划（项目编号：2024C01137）和国家重点研发计划（项目编号：2021YFF0602802）的支持。
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢浙江省农业科学院和浙江迪富伦生物科技有限公司提供细菌菌株样本；以及感谢浙江迪普诊断技术有限公司提供技术支持。
