蛋白质组分析发现核仁蛋白（nucleolin）是一种能与U3小亚基结合的蛋白质，能够抑制禽白血病病毒的复制

《Veterinary Microbiology》：Proteomic profiling identifies nucleolin as a U3-interacting protein that inhibits avian leukosis virus replication

【字体：大中小】 时间：2026年03月10日 来源：Veterinary Microbiology 2.7

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　　禽白血病病毒（ALV）U3区与宿主蛋白相互作用机制研究。采用表面等离子共振（SPR）结合质谱技术鉴定出181个与U3区结合的宿主蛋白，其中核仁蛋白（NCL）通过直接结合抑制U3区转录活性，敲低NCL显著增强病毒gp85 mRNA表达及复制，而过表达NCL则抑制病毒蛋白表达。研究揭示了NCL调控ALV复制的分子机制，为新型抗逆转录病毒策略提供靶点。

中国山东省农业科学院动物科学与兽医研究所，济南

摘要

禽类逆转录病毒的长末端重复序列（LTR）已被广泛研究，作为强大的转录调控单元的模型。LTR的U3基因包含许多顺式作用元件和反式作用因子，这些因子与多种宿主转录因子结合，形成一个复杂的网络，调控病毒和宿主基因的高水平转录。然而，与U3基因结合的宿主蛋白及其作用机制在很大程度上仍不清楚。在本研究中，我们结合表面等离子体共振技术和质谱技术，鉴定了与禽白血病病毒（ALV）U3基因结合的蛋白质。共鉴定出181种与U3结合的蛋白质，其结合得分大于20分。其中6种蛋白质的结合得分超过120分，通过siRNA转染成功实现了敲低；当核仁蛋白（NCL）表达下调时，ALV gp85 mRNA的转录显著增加。通过组合使用siRNA，优化了NCL干扰的效果，发现NCL下调显著增强了LTR的转录活性和U3的增强能力，进而提高了病毒蛋白的表达。相反，NCL过表达显著降低了LTR的转录活性、U3的增强能力以及病毒蛋白的表达水平。这些数据表明NCL在抑制ALV复制中起着关键作用，并为从新角度开发针对逆转录病毒的策略提供了分子基础。

引言

禽白血病病毒（ALV）是一种α逆转录病毒，首次记录于19世纪（Temin和Rubin，1958年），是全球家禽生产中主要的病原体。它会引起肿瘤性疾病、免疫抑制、生育能力下降和产蛋量减少，导致巨大的经济损失（Fandi?o等人，2023年；Li等人，2019年）。尽管进行了大量研究，但目前尚无 commercially available的疫苗或有效的药物干预措施来控制ALV（Tang等人，2022年）。目前的管理策略主要集中在通过重组鸡IFN-α、抗病毒化合物（如齐多夫定）和针对病毒基因的RNA干扰等方法来抑制病毒复制，这些方法在体外显示出疗效（Dai等人，2016年；Qian等人，2014年；Wang等人，2021年）。此外，通过CRISPR/Cas9技术对宿主因子进行基因工程改造，通过删除鸡的W38氨基酸，成功培育出了抗ALV的禽类品系，为疾病预防提供了有前景的策略（Koslová等人，2020年；Liu等人，2024年）。然而，最近的研究揭示了这一策略的显著局限性：W38缺失所赋予的病毒抗性容易受到适应性突变的影响，表明要实现牢固的免疫力需要更复杂的基因改造（Matou?ková等人，2024年）。

ALV基因组遵循典型的逆转录病毒结构，两侧有长末端重复序列（LTR），这些序列在病毒整合、转录和致病性中起着关键作用（Fandi?o等人，2023年）。LTR分为U3、R和U5三个区域，其中U3区域是一个重要的调控中心。它包含关键的启动子和增强子元件，如CCAAT、CArG和Y框，这些元件与宿主转录因子相互作用，调节病毒基因的表达（Hayward等人，1981年）。鉴于U3区域在启动病毒转录中的核心作用，它是理解病毒-宿主相互作用和开发抗病毒策略的关键焦点。然而，直接与ALV U3区域相互作用的宿主蛋白的组成仍知之甚少（Ruddell，1995年；Ruddell等人，1988年）。迄今为止，只有少数因子（如肿瘤抑制因子p53和转录调节因子YY1）被报道可以与U3区域结合并影响病毒复制（Duan等人，2022年；Bernhard等人，2013年；Wang和Goff，2020年）。这些蛋白质可以招募染色质修饰复合体（如HDAC1/2）来抑制病毒转录，突显了表观遗传调控在ALV潜伏期和再激活中的作用。然而，对U3结合蛋白的系统分析仍然缺乏，这使我们对于宿主因子如何调节ALV转录的理解存在显著空白。

在这项研究中，我们采用了一种综合方法，结合DNA pull-down测定和基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学技术，全面鉴定了与ALV U3区域相互作用的宿主蛋白。我们确定核仁蛋白（NCL）是一个高置信度的结合伙伴，并通过功能测定证明了其作为ALV转录负调控因子的作用。此外，我们还使用微尺度热泳（MST）验证了NCL与U3之间的物理相互作用。这些发现不仅扩展了我们对ALV LTR处病毒-宿主相互作用的了解，还揭示了通过转录调控抑制病毒复制的新型抗病毒策略的潜在靶点。

细胞、病毒和质粒

HEK293T细胞（ATCC CRL-3216）和DF-1细胞（ATCC CRL-12203，传代15–25）在含有10%胎牛血清（FBS；Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco）中培养，培养条件为37°C和5% CO?环境。本研究中使用的ALV JS11C1菌株（K亚群）最初于2012年从中国本地鸡品种中分离得到（Cui等人，2014年）。生成并使用了以下质粒构建体：pGL3-LTR和pGL3-U3-promoter载体，这些载体能够表达...

U3结合蛋白的蛋白质组学筛选

为了鉴定与ALV U3区域相互作用的宿主蛋白，我们使用来自ALV JS11C1菌株的生物素化基因组U3序列和DF1细胞提取物进行了SPR-MS测定（图1A）。对捕获的蛋白质进行质谱分析后，鉴定出181种高置信度的U3结合候选蛋白（置信度得分大于20分）（图1B）。在前20种得分超过120分的蛋白质中，包括肌动蛋白、filamin、NCL以及14-3-3蛋白的几种异构体。值得注意的是，其中62种蛋白质是已知的...

讨论

本研究首次系统地描述了与ALV U3区域相互作用的宿主蛋白，确定了NCL作为ALV复制的关键负调控因子。我们的数据表明NCL直接结合U3区域，抑制LTR的转录和增强活性。这一结论得到了实验结果的一致支持：NCL敲低后，病毒gp85 mRNA和p27蛋白的水平升高，而其过表达则降低了这些蛋白的水平。重要的是，MST测定证实了NCL与U3之间的直接相互作用...

结论

总之，本研究首次系统地描述了与ALV U3区域相互作用的宿主蛋白，并确定了NCL作为通过直接结合U3和抑制LTR来抑制ALV复制的重要因子。NCL与p53之间的相互作用揭示了宿主抗病毒防御的新机制。这些发现不仅加深了我们对禽类逆转录病毒-宿主相互作用的理解，还突出了NCL-U3界面作为新型抗病毒策略的潜在靶点。

CRediT作者贡献声明

Ziqi An：研究、数据分析。Qinghua Huang：撰写初稿、方法学设计、研究。Peipei Wang：验证、研究、数据分析。Ning Cui：软件开发、资金获取、数据分析。Chuantian Xu：撰写、审稿与编辑、资金获取。Shuai Su：撰写、审稿与编辑、监督、数据管理。Yawen Liu：数据管理、验证。