《Veterinary Microbiology》：Investigating contagious transmission of
Mannheimia haemolytica in feedlot calves by leveraging whole genome sequences of a unique isolate collection
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为了解决溶血曼氏杆菌（Mh）在牛呼吸道疾病（BRD）中是条件性致病还是存在接触性传播，以及耐药菌株如何扩散的争议，研究人员对2020年进入萨斯喀彻温省育肥场的400头犊牛进行了纵向研究，通过全基因组测序（WGS）分析了来自4个相邻围栏的485个Mh分离株。研究发现，在抵达后的13天内，Mh遗传多样性急剧下降，出现了在围栏内和围栏间传播的优势克隆群（如集群F和G），且这些优势集群普遍携带多重耐药基因。这为Mh的接触性传播及耐药性在育肥场环境中的快速选择与扩散提供了直接证据，对优化BRD防控策略具有重要意义。
在养牛业中，牛呼吸道疾病（Bovine Respiratory Disease, BRD）是导致肉牛发病和死亡的首要原因，给产业带来巨大经济损失。传统观点认为，溶血曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica, Mh）作为一种条件性致病菌，通常在牛只因病毒感染、运输等应激导致免疫力下降时，其体内原本存在的菌株才会过度增殖并引发疾病。然而，近年来有证据表明，某些特定的Mh菌株，特别是那些对常用治疗药物耐药的菌株，可能像感冒病毒一样，能够在易感的牛群中相互传染。如果耐药菌株真的能在拥挤的育肥场环境中大规模接触性传播，将严重威胁患病动物的治疗效果和福利，也使得我们对抗菌药物的管理面临严峻挑战。那么，Mh到底会不会“传染”？它的传播是仅限于一个围栏内部，还是能跨越围栏，通过共用的栅栏、饮水槽或处理设施扩散开来？为了回答这些关键问题，一支由Emily R. Snyder、Jennifer Abi Younes、Elaine M. Bird、Stacey R. Lacoste和Cheryl L. Waldner组成的研究团队展开了深入调查，其研究成果发表在《Veterinary Microbiology》上。
为了探究Mh在育肥场中的传播动态，研究人员巧妙地利用了一个独特的样本库。他们选取了2020年秋季通过拍卖市场进入加拿大萨斯喀彻温省一个育肥场的400头阉牛，这些牛被安置在四个相邻的围栏中（每个围栏100头）。所有牛在抵达时都接受了标准的处理，包括接种疫苗（含Mh类毒素的5联改良活病毒疫苗及梭菌疫苗）以及使用泰拉霉素（Tulathromycin）进行预防性投药。研究团队在牛只入栏第1天、第13天和第36天，通过深部鼻咽拭子采集样本。通过对分离出的Mh进行培养和鉴定，最终对485个Mh分离株进行了全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS），以分析其系统发育关系和抗菌素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）基因。核心分析技术包括：基于单核苷酸多态性（SNP）的系统发育分析（以≤6个SNP差异定义克隆群）、利用Fisher精确检验分析克隆群与牛只来源牧场之间的关联，以及通过ABRicate软件比对综合抗生素耐药性数据库（CARD）和MEGARes数据库，进行耐药基因的计算机模拟鉴定。
3.1. 分离、测序与组装
研究共确认了489个Mh分离株并纳入后续分析，基因组大小中位数为2.59 Mbp。通过测序与组装，为后续的高分辨率遗传分析奠定了基础。
3.2. 基于SNP的系统发育分析
这是本研究揭示Mh种群动态的核心发现。通过SNP分析，所有分离株被划分为64个不同的遗传集群。
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遗传多样性急剧下降：在入栏第1天，分离株分布在56个不同的集群中，显示出高度的遗传多样性。然而到了第13天，独特集群数量锐减至26个，每个围栏内都有一到两个集群成为绝对优势。例如，在围栏2045A、2046A和2046B中，集群F分别占据了该围栏分离株的87%、65%和84.5%。在围栏2045B中，集群G则占据了98%的分离株。
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围栏间传播的证据：重要发现是，集群F在入栏第1天并未在围栏2046B中检测到，却在第13天成为该围栏的优势菌株。由于2046B与2046A相邻且共享水源，这一结果为Mh可能通过围栏接触或共享设施在围栏间传播提供了有力证据。
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后期变化：到第36天，由于只对40头牛进行了抽样，结果可能无法完全代表当时的多样性，但分离株仍分布在10个集群中，优势集群依然存在。
3.3. 克隆群与来源牧场关联性分析
通过统计分析，研究人员发现了一个有趣的现象：在入栏第1天和第13天，Mh的遗传集群与牛只的原始来源牧场存在显著关联。这意味着，来自同一牧场的牛更可能携带相同遗传类型的Mh。然而，到了第36天，这种关联性消失了。这进一步支持了“克隆扩张”假说：在育肥场早期，少数优势菌株（无论其最初来自哪里）通过接触性传播迅速扩散，逐渐掩盖了它们与原始牧场的联系，形成了育肥场内新的、占主导地位的微生物种群。
3.4. 计算机模拟鉴定抗菌素耐药基因
通过对基因组数据的挖掘，研究共发现了7种耐药基因：strA, aphA1, strB, mphE, msrE, estT, sul2和 tetH。
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优势集群携带耐药基因：所有成为优势的克隆群（如F和G）都携带AMR基因，通常携带3个（mphE, msrE, sul2），而有些集群（如E和LL）则携带多达5-6个耐药基因。
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耐药基因的动态变化：在围栏内部和不同时间点之间，特定集群的耐药基因谱基本一致，但也发现了例外。例如，集群G的分离株在入栏时未检测到耐药基因，但在围栏2045B中成为优势菌株的第13天，却获得了mphE, msrE, sul2这三个耐药基因，提示其在传播过程中可能通过水平基因转移获得了耐药基因盒。
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表型与基因型耐药的差异：一个值得注意的发现是，在入栏第1天，虽然通过基因检测发现部分分离株携带了对泰拉霉素（一种15元环大环内酯类药物）的耐药基因mphE和msrE，但之前同一批样本的表型药敏试验却显示对泰拉霉素的耐药率极低。这种基因型与表型的不匹配，提示可能存在未知的耐药机制、基因表达调控或其他因素影响。
4. 讨论与结论
本研究通过高分辨率的全基因组测序，以前所未有的细节描绘了Mh在育肥犊牛早期喂养阶段的种群演变图景。主要结论和意义体现在以下几个方面：
首先，研究为Mh在育肥场环境中的接触性传播提供了强有力的分子证据。Mh种群从入栏时的高度遗传多样性，迅速演变为以少数几个克隆群为主导的“近乎单一的遗传文化”，这种快速的克隆扩张只能通过菌株在牛只之间的有效传播来解释。更重要的是，研究发现优势集群（如集群F）可以从一个围栏“跳跃”到相邻的、入栏时并未检出该菌株的围栏，这表明传播不仅限于围栏内部，也可能通过围栏接触、共享水源等途径在围栏间发生。这改变了以往认为Mh仅是条件性致生的观点，将其明确为一种可在密集饲养环境中接触性传播的病原体。
其次，研究揭示了抗菌药物使用对耐药菌株的选择性压力。所有在入栏后迅速扩张并成为优势的克隆群，普遍携带针对预防性用药泰拉霉素的耐药基因（mphE/msrE）或其他多重耐药基因。这表明，抵达育肥场时使用的泰拉霉素预防性投药，可能直接筛选并促进了这些耐药克隆群的生长优势，使其在竞争中脱颖而出并迅速传播。这警示我们，防控性抗生素的使用在试图保护动物健康的同时，也可能无意中助推了耐药性问题的蔓延。
第三，研究指出了传播可能始于育肥场之前。一个惊人的发现是，那些后来在育肥场内成为“霸主”的优势菌株（如F和G），在牛只刚抵达育肥场的第1天，就已经以较低比例存在于几乎所有围栏的牛群中。并且，早期Mh的遗传类型与牛只的原始来源牧场显著相关。这强烈暗示，这些具有传播潜力和耐药性的菌株，可能在牛只进入育肥场之前的环节，如共同的拍卖市场、运输车辆或集运场，就已经发生了交叉污染和传播。因此，控制耐药Mh的传播，可能需要将干预措施前置到育肥场之前的供应链环节。
最后，研究揭示了基因型耐药与表型耐药的复杂性。研究发现，在入栏早期，携带已知大环内酯类耐药基因的菌株并未表现出相应的表型耐药，而到后期相关性增强。同时，同一克隆群内也出现了耐药基因谱不一致的情况。这表明，目前对Mh耐药性的认知仍不完全，可能还存在未知的耐药基因、基因表达的精密调控（如调节基因的作用）或其他的适应性优势。这强调了继续深入研究Mh耐药机制的必要性。
综上所述，这项研究不仅证实了Mh在育肥场牛群中可通过接触性传播，并会因抗菌药物使用而选择性扩增耐药克隆，还将其传播链的可能起点指向了育肥场之前的环节。这些发现对于重新审视和制定更有效的BRD综合防控策略具有重要指导意义：在关注围栏内管理的同时，也应评估和改善牛只进入育肥场前的聚集和流通环节的卫生与生物安全措施，并更加审慎地使用预防性抗菌药物，以减缓耐药性的产生与传播。
