《Nature Communications》：FLEXTAG: a small and self-renewable protein labeling system for anti-fading multi-color super-resolution imaging
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超分辨率成像的广泛应用受限于现有蛋白标记系统的光漂白、固定后标记效率低、多色能力受限等问题。为此，研究人员开发了FLEXTAG蛋白标记系统。该系统包含三个正交、小型、可自我更新的蛋白标签，支持长时间、高分辨率、多色活细胞和固定细胞成像，兼容SIM、STED、PAINT等多种超分辨率技术，并开发了保护性固定方法，显著提高了标记效率。这为细胞生物学的基础和转化研究提供了强大工具。
在生物学的微观世界里，细胞结构和分子相互作用复杂而精妙，要想看清它们的真实面貌，科学家们需要一台足够强大的“显微镜”。传统的荧光显微镜受限于光的衍射极限，其分辨率只能达到约250纳米，这大约是一个蛋白质平均尺寸的50倍，因此许多关键的亚细胞细节长期以来都笼罩在模糊之中。近十年来，超分辨率荧光成像技术（也称为荧光纳米显微术）的出现，突破了这一极限，将空间分辨率提高到了分子尺度（1-20纳米），使我们能够以前所未有的清晰度观察细胞内蛋白质复合物的组织、细胞结构的纳米级变化以及动态的分子相互作用，为理解生命过程提供了革命性的工具。
然而，这项强大的“看清”技术，其有效性高度依赖于精确的蛋白质标记策略。目前主流的标记方法各有局限：免疫荧光法虽然能标记内源性蛋白，但仅限于固定细胞，且抗体分子巨大（约150 kDa），难以接近密集的细胞结构；荧光蛋白标签（如EGFP）适用于活细胞成像，但其亮度和光稳定性通常不如有机染料；自标记蛋白标签（如HaloTag、SNAP-Tag）虽然结合了有机染料的优势，兼容活细胞和固定细胞，但光漂白——即在长时间高强度激光照射下荧光信号逐渐消失——仍然是限制其，特别是超分辨率成像应用的主要瓶颈。此外，在固定细胞成像中，常用的固定剂（如多聚甲醛PFA）会引起蛋白质广泛的交联，阻碍染料标记的配体接近其靶点，导致标记效率显著降低。另一个挑战在于如何将标记系统的光谱范围扩展到多色成像，这对于同时研究多个生物分子的相互作用至关重要。
为了克服光漂白，近年来出现了可自我更新（即可交换）的蛋白质标签，允许在成像过程中不断用新鲜的荧光染料替换被漂白的染料。然而，早期的尝试，如基于绿色荧光蛋白类似发色团的可逆结合系统（如pFAST），由于其亮度低、光稳定性差，与STED成像不兼容，并且在PAINT成像中，发色团会在光照下降解，阻止其重新结合。更重要的是，这些标签的荧光特性与其结合机制紧密耦合，对其化学结构的微小修改都可能破坏标签识别，这极大限制了其颜色扩展的能力。最近，基于HaloTag改造的可交换系统取得了一些进展，但其较大的标签尺寸（约33 kDa）可能干扰被标记蛋白的天然定位和功能，导致实验假象，并且目前尚缺乏能在多种超分辨率技术（如PLIM和SMLM）中都能工作的、正交的、可自我更新的标签系统来实现三色或更多色的超分辨成像。此外，现有标签也未能有效解决固定后标记效率低下的问题。
在这一背景下，一项发表于《自然·通讯》（Nature Communications）的研究带来了突破。该研究团队开发了一个名为FLEXTAG（可交换、抗干扰、通用型纳米显微术荧光标记）的综合性蛋白质标记框架。FLEXTAG的核心是三个正交、超小型（12-18 kDa）、可自我更新的蛋白质标签（FLEXTAG1, FLEXTAG2, FLEXTAG3），它们共同克服了现有标记系统的主要局限。通过有机荧光团的连续交换，FLEXTAG支持在活细胞和固定细胞中进行长时间的高分辨率成像，且光漂白最小。它与主流的超分辨率成像模式兼容，如结构光照明显微术（SIM）、受激发射损耗显微术（STED）、随机光学重建显微术（STORM）和点积累成像纳米地形学（PAINT）。为了进一步解决固定引起的标记效率低下和背景荧光问题，研究人员还开发了一种创新的基于保护策略的固定方法和化学封闭策略，显著保留了标签的可及性并提高了信噪比。总之，FLEXTAG能够实现对亚细胞靶点动态行为和相互作用的长期追踪，以及对纳米级蛋白质组织和细胞结构的图谱绘制，推动了细胞生物学基础研究和转化应用的进步。
为了构建和验证FLEXTAG系统，研究人员运用了多项关键技术。首先，他们利用计算工具（如ColabFold）对蛋白质结构进行预测和工程化改造，以优化标签的单体性、结合动力学和稳定性，例如通过引入点突变（如FLEXTAG1的L55A, H105A, M120G）来破坏二聚化界面。其次，他们合成了多种染料（如TMR, MaP555, JF635, AF488等）与特定小分子配体（ET-JQ1, TMP, SLF‘）的偶联物，用于标记和成像。关键的实验方法包括：通过活细胞和固定细胞的宽场荧光成像评估标签的定位准确性和标记效率；利用线粒体形态学实验定量评估标签的聚集倾向；通过单分子定位显微术（SMLM），特别是PAINT成像，量化配体结合的事件率和表观解离率，以评估标签的自我更新动力学。此外，他们系统优化了固定和封闭流程，包括测试不同固定剂（PFA, GA, 乙二醛等）、还原剂（NaBH4）和封闭剂（BSA, Tween-20, KSCN）的组合，以最小化非特异性结合。最后，他们利用SIM、STED、PAINT和STORM等多种超分辨率成像平台，全面验证了FLEXTAG系统在抗光漂白和多色成像方面的卓越性能。
FLEXTAG1、FLEXTAG2和FLEXTAG3的开发与表征
研究人员从三个已知的蛋白质-配体系统出发，通过理性设计和突变筛选，开发了三个正交的FLEXTAG。
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FLEXTAG1的开发：基于人BRD4蛋白的第二个溴结构域突变体（BRD4BD2L55A）及其配体ET-JQ1。初始标签存在强烈的二聚化倾向，导致被标记蛋白（如线粒体蛋白TOM20）严重聚集。通过结构预测和点突变筛选，研究人员引入了M120G和H105A突变，成功破坏了其固有的和二聚体界面，得到了几乎不聚集且保持高效结合的突变体BRD4BD2L55A, H105A, M120G，即FLEXTAG1。它在PAINT成像中表现出高的事件率和合适的表观解离率。
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FLEXTAG2的开发：基于大肠杆菌二氢叶酸还原酶（eDHFR）及其配体甲氧苄啶（TMP）。野生型eDHFR标记效率相对较低。研究人员假设其固有的结构不稳定性是原因之一，并设计了一系列旨在稳定其结构的突变体，包括引入分子内二硫键。其中，在N端添加多聚甘氨酸 linker并在第89位引入半胱氨酸的突变体C(G)5-eDHFRP89C表现最佳，其标记效率相比野生型提高了约3.3倍，且PAINT成像中的配体交换动力学更快，该突变体被命名为FLEXTAG2。
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FLEXTAG3的开发：基于人FKBP12蛋白的突变体FKBPF36V及其高亲和力配体SLF‘。虽然其“撞洞”配对提供了特异性，但过高的亲和力导致配体交换动力学缓慢，不利于自我更新。研究人员筛选了靠近结合口袋的单个点突变，发现I91A突变在适度降低亲和力、保持足够标记亮度的同时，显著加快了配体交换速率，使其非常适合PAINT成像。该突变体FKBPF36V, I91A被命名为FLEXTAG3。
降低非特异性结合和实现保护性固定的策略
针对固定细胞成像中非特异性结合强和标记效率低的问题，研究人员开发了优化方案。
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降低非特异性结合：系统评估发现，使用PFA+GA固定后，用NaBH4还原，能有效减少由醛基引起的背景。进一步的封闭实验表明，联合使用BSA、Tween-20和硫氰酸钾（KSCN）能最大程度地抑制疏水和静电相互作用导致的非特异性结合。此外，选择亲水性更强或具有荧光原特性的染料也能有效降低背景。
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保护性固定：为了解决固定剂交联导致标签结合口袋可及性下降的问题，研究人员提出了“保护性固定”策略。即在固定前和固定过程中，用高浓度的、不含染料的对应配体（如TMP用于FLEXTAG2）预处理细胞。这些“保护剂”预先占据标签的结合口袋，使其保持在与配体结合的构象，从而在固定过程中屏蔽了交联反应，保护了结合位点。固定并洗涤后，再用染料标记的配体进行染色。这一策略将FLEXTAG1/2/3在固定后的标记效率提升至活细胞水平的60-67%，相较于常规固定方法有3.9至8.8倍的显著改善。
FLEXTAG在PLIM和SMLM超分辨成像中的应用与抗光漂白性能
研究团队全面评估了FLEXTAG在各种超分辨率技术中的表现。
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在PLIM技术中的应用：FLEXTAG支持灵活的多色成像。研究人员合成了连接不同光谱染料（如JF525, TMR, MaP555, JF635）的配体，成功在活细胞和固定细胞中实现了三色SIM成像，清晰展示了线粒体、微管和内质网的空间交互。在STED成像中，FLEXTAG也实现了双色成像，分辨率显著高于共聚焦显微镜。最关键的是，FLEXTAG的可自我更新特性赋予了其卓越的抗光漂白能力。在长达30帧的连续SIM成像中，标记了FLEXTAG的样品荧光信号保持稳定，而使用非可交换的HaloTag或交换缓慢的FKBPF36V的样品信号则严重衰减。
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在SMLM技术中的应用：FLEXTAG与PAINT成像原理天然契合，其动态交换的配体可直接用于产生随机闪烁信号，无需抗体或DNA探针，标记尺寸更小。研究人员展示了FLEXTAG1/2/3分别与绿色、红色、远红色染料配体组合的三维PAINT成像，并成功与phalloidin-PAINT整合，实现了肌动蛋白、线粒体和内质网的三色PAINT成像。在STORM成像中，研究人员将FLEXTAG3与自发闪烁染料HMSiR偶联，实现了活细胞线粒体的动态STORM成像。在长达4.5分钟的连续成像中，FLEXTAG3的定位点存活率高达96.6%，远高于其他对照标签，并且在多轮时间推移成像中信号衰减极小，证明了其在长期、动态SMLM成像中的巨大优势。
结论与意义
本研究成功开发了FLEXTAG——一个集成了三个小型、正交、可自我更新的蛋白质标签及其配套优化方案的综合性标记框架。该系统有效地解决了当前超分辨率成像在光漂白、标签诱导的假象、固定后标记效率低以及多色成像能力有限等方面的长期挑战。
FLEXTAG的重要意义在于其“全能”特性。首先，其小型化标签（均小于20 kDa）最大程度地减少了对被标记蛋白定位和功能的干扰，提高了空间定位的准确性。其次，其可自我更新的机制为各种超分辨率技术提供了强大的抗光漂白能力，使得长时间、高分辨率的动态观测成为可能。第三，通过将荧光染料的性质与标签结合机制解耦，并结合多种高性能有机染料，FLEXTAG实现了灵活、高效的多色成像。最后，研究人员开发的“保护性固定”和非特异性结合降低策略，不仅提升了FLEXTAG在固定细胞中的性能，其原理也普遍适用于其他蛋白质标记系统。
综上所述，FLEXTAG作为一个通用、稳健的超分辨率蛋白质标记系统，能够实现对亚细胞结构和分子相互作用的长期、多色、纳米级解析，极大地扩展了荧光纳米显微术的应用边界，为细胞生物学、神经科学、病原体-宿主相互作用等诸多领域的机制研究和未来转化应用（如药物靶点可视化、疾病生物标志物发现等）提供了强大的工具。
