《Nutrients》：Structured Exercise Modulates Gut Microbiota Composition and Protects Against Diet-Induced Dysbiosis in a Rat Model
Fatiha M. Benslimane,
Maha Alser,
Abdelrahman M Elgamal,
Layla I. Mohammed,
Zain Zaki Zakaria,
Sara Sokary,
Muhammad Umar Sohail,
Ayat S Hammad,
Saddam Akber Abbasi and
Maha Al-Asmakh
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本研究表明，在饮食和运动的共同作用下，结构化的运动方案，特别是定期的跑步机训练，能够有效重塑高脂饮食（HFD）喂养大鼠的肠道菌群结构。研究揭示了这种相互作用可显著富集有益菌属（如Akkermansia、Blautia），并降低潜在病原菌的丰度，提示标准化运动是调节肠道微生物、改善代谢健康的重要途径。
引言
哺乳动物的胃肠道是大约10万亿至100万亿微生物的家园，它们被统称为肠道微生物群，在宿主的能量稳态、代谢调节和内分泌功能中扮演着关键角色。这些微生物通过多种方式保护宿主，例如与病原体竞争定植位点，并产生具有抗炎特性和增强肠道屏障完整性的代谢产物，如短链脂肪酸（SCFAs）。肠道菌群失调与肥胖、2型糖尿病（T2D）和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）密切相关。虽然饮食、抗生素暴露、年龄和性别等因素已被公认为肠道菌群组成的重要调节因素，但在饮食干预的背景下，体育锻炼，特别是运动方式的作用，仍未被充分了解。
肥胖显著增加2型糖尿病、心血管疾病、高血压和某些癌症的风险。肥胖及其相关代谢紊乱（ORMDs）的病因是多因素的，涉及遗传易感性和环境因素之间复杂的相互作用。久坐的生活习惯加上高脂肪、高能量的饮食，导致肥胖相关代谢紊乱在全球范围内，尤其是在发达国家和海湾地区日益增多。高脂饮食已知会改变肠道菌群组成，促进与肥胖和代谢功能障碍呈正相关的细菌类群。相反，体育锻炼可以减轻这些致肥效应，并重塑肠道微生物群落。
越来越多的证据表明，运动通过改变肠道转运时间、调节胆汁酸代谢、增加短链脂肪酸产生、调节免疫和改善肠道屏障功能等几种可能的机制来影响肠道菌群组成。运动参数，特别是FITT（频率、强度、时间和类型）原则所描述的参数，被认为对这些机制的调节方式不同，运动类型和强度的变化会产生不同的微生物反应。然而，大多数研究孤立地考察饮食或运动的影响，关于不同运动方式如何与饮食模式相互作用以塑造肠道微生物组，仍存在关键的知识空白。
自愿运动和强迫运动代表了两种根本不同的范式，它们不仅在强度和规律性上不同，其神经内分泌反应也存在差异。强迫跑步机运动通常引发更高的皮质酮反应，并能提供标准化的强度、持续时间和频率，而自愿跑轮运动在个体动物之间的总距离、运动模式和相关生理应激方面存在显著差异。这些差异可能对肠道生理和微生物生态产生不同的影响，值得进行直接比较。尽管如此，这些运动方式对饮食引起的微生物变化的独特影响尚未得到明确定义。
威斯塔大鼠模型在研究饮食诱导的代谢失调方面已得到广泛确立，具有饮食摄入可控、运动方案标准化和遗传变异减少等优势，使其特别适合研究饮食-运动-微生物群之间的相互作用。因此，本研究旨在表征饮食类型（正常饲料与高脂饮食）和运动方式（久坐、自愿跑轮运动或强迫跑步机运动）对大鼠肠道微生物群多样性、分类组成和关键细菌类群丰度的联合及交互影响。
材料与方法
该研究的所有动物均在卡塔尔大学实验动物研究中心饲养。研究涉及63只威斯塔大鼠，研究开始时为10周龄，根据饮食摄入（正常饲料和高脂饮食）和运动状态（对照组、自愿运动组和强迫运动组）随机分为六个实验组。初步分析显示，肠道菌群组成在性别之间没有显著差异；因此，将两性的数据合并用于所有后续分析。
动物被饲养在标准条件下的独立通风笼中。在整个研究期间，动物可自由饮水。动物被喂食正常饲料或高脂饲料。正常饲料为SAFE 150日粮，高脂日粮对应于260HF日粮。运动方案如下：经过一周的适应期后，强迫运动组在大鼠跑步机上进行跑步运动，每周5天，持续8周。自愿运动组被饲养在有自由24小时访问轮式跑轮的笼子中，持续时间相同。对照组在标准笼中保持久坐状态。在干预结束时，从盲肠收集粪便样本用于微生物组分析。在整个研究过程中，记录体重变化。
结果
3.1. 研究动物特征
在研究开始时，饮食组之间的平均体重具有可比性。干预结束时，两组动物的体重均增加了约一倍。不同运动方式下的平均每日跑步距离差异显著。自愿运动组大鼠表现出显著更高但高度可变的自主活动，而强迫跑步机组则保持标准化距离。值得注意的是，高脂喂养与自愿跑步距离减少相关。在运动方式中，与强迫跑步机运动相比，接受自愿运动的大鼠表现出更低的总体重增加。
3.2. 饮食和运动对肠道菌群多样性和群落的影响
为了评估饮食和运动如何影响肠道微生物多样性和群落结构，使用16S rRNA测序数据分析六个实验组的α和β多样性指标。
3.2.1. α多样性
通过香农指数和Sobs指数评估六个大鼠组的α多样性。饮食类型对肠道微生物多样性影响最大。与相应的正常饲料组相比，所有高脂饮食组的香农多样性均观察到统计学上的显著增加。香农指数值在正常饲料组中为2.76至2.94，在高脂饮食组中为3.47至3.63。同样，使用Sobs指数进一步评估了物种丰富度。所有高脂饮食组始终表现出比正常饲料组更高的物种丰富度。值得注意的是，在高脂饮食条件下观察到的α多样性增加并不一定表明微生物健康状况改善。总体而言，这些发现表明高脂饮食增加了肠道微生物的多样性和丰富度，而运动进一步调节了这些效应，强迫运动比自愿运动产生更强的影响。
3.2.2. β多样性
使用布雷-柯蒂斯相异性指数评估实验组之间微生物群落组成的差异。主坐标分析（PCoA）显示了这些差异。PERMANOVA分析显示了一个高度显著的影响，表明饮食类型和运动都显著影响肠道菌群组成。在两组饮食之间观察到明显的分离。高脂饮食组在主坐标分析图的右侧明显聚集，而正常饲料组聚集在左侧。这种分离突出了饮食对微生物群落结构的主导影响。在饮食组内部的亚聚类进一步表明了运动的影响。在高脂饮食组内，每个运动亚组的中心点明显分离，反映了运动对微生物组的调节作用。相反，在正常饲料组内，对照组和自愿运动组显示出大量重叠，而强迫运动组则形成了一个独特的聚类。这表明在正常饮食条件下，强迫运动对微生物结构产生更强的影响。总之，这些发现支持了饮食是肠道菌群结构的主要驱动因素，而运动则以依赖于背景的方式调节群落组成。
3.3. 分类学分析
为了进一步表征饮食干预和运动引起的微生物群落变化，在门、属和种的水平上检查了分类组成。
3.3.1. 门水平的肠道菌群相对平均丰度
在六个实验组中，16S rRNA基因测序分析鉴定出十个已知的细菌门和一个未知门。大鼠肠道微生物组主要由四个主要门组成，其相对丰度各不相同：厚壁菌门、拟杆菌门、脱铁杆菌门和变形菌门。在不同组中观察到放线菌门和疣微菌门的分布存在额外差异。
在所有组中，厚壁菌门是主要门，其平均相对丰度在86.5%到98.0%之间。然而，与对照组-正常饲料组相比，高脂饮食组的厚壁菌丰度降低。相比之下，拟杆菌门在所有组中的相对丰度都较低，在自愿运动-高脂饮食组和强迫运动-高脂饮食组中观察到略有增加。在高脂饮食条件下，脱铁杆菌门的平均相对丰度略有降低；然而，自愿和强迫运动似乎都能部分恢复其丰度。在高脂饮食组中，放线菌门和变形菌门显示出相对丰度增加，表明与饮食相关的微生物组成变化。值得注意的是，疣微菌门仅在高脂饮食的运动组中检测到，表明在高脂肪饮食条件下，存在运动依赖性调节。
3.3.2. 属和种水平的肠道菌群相对平均丰度
进一步分析了属和种水平的16S rRNA基因测序数据。通过将全长16S rRNA基因序列与NCBI 16S rRNA数据库进行比对，并采用严格标准，提供了高可信度的物种水平分类鉴定。基于该方法，共将508个属分类为1020个物种。在正常饲料条件下，优势属包括乳杆菌属、动线菌属和艾森伯格菌属。相比之下，高脂饮食条件的特点是消化球菌属、罗姆布茨菌属和布劳特菌属的丰度更高。运动调节了这些模式，自愿和强迫运动都与有益代谢功能相关的属的富集有关。同样，在正常饲料组中，优势种包括嗜木动线菌、沃氏肠杆菌和约翰逊乳杆菌。相反，在高脂饮食组中，黑色消化球菌、回肠罗姆布茨菌和猿消化球菌的丰度更高。运动进一步影响了物种水平的组成，其中乳酸卢瑟尼杆菌和产硫磺硫酸还原孢菌仅在强迫运动-高脂饮食组中检测到。
乳杆菌属成员在正常饲料喂养的大鼠中最为丰富，而在两种饮食条件下的自愿和强迫运动组中，其相对丰度均下降。相比之下，阿克曼菌属对饮食和运动表现出显著的反应。它仅在运动的高脂饮食组中检测到，并且随着自愿和强迫运动而显著增加。在物种水平上，阿克曼菌在运动的高脂饮食组中表现出显著更高的相对丰度。
饮食和运动也影响了几种潜在致病菌的丰度。在久坐和自愿运动的高脂饮食组中，几种潜在的致病菌富集，但在所有其他组中，包括强迫运动-高脂饮食组中，这些致病菌缺失或显著减少。这些包括弗氏志贺菌、弗格森埃希菌、宋内志贺菌、奇异变形杆菌和大肠杆菌。值得注意的是，在高脂饮食条件下的强迫运动完全消除了这些物种的检测，表明结构化运动对饮食诱导的致病菌富集具有保护作用。
3.4. 相关性分析
为了探索运动参数与微生物群组成之间的潜在关联，在实验组内进行了微生物类群丰度与生理变量之间的相关性分析。相关性分析在自愿运动和强迫运动的高脂饮食组中进行。仅在强迫运动-高脂饮食组中检测到显著关联，这可能归因于标准化的运动刺激以及与自愿运动组相比跑步距离的个体间差异较低。自愿运动组的结果不显著，因此未详细呈现。
研究结果显示运动组中疣微菌门的相对丰度增加，这主要是由于高脂饮食的运动组中阿克曼菌属的富集所致。为了进一步检查运动参数与阿克曼菌丰度之间的关联，进行了相关性分析。
在强迫运动-高脂饮食组内进行了斯皮尔曼相关性分析。结果显示，平均移动距离与阿克曼菌的相对丰度之间存在显著正相关。在强迫运动条件下，移动距离与测试大鼠肠道菌群中阿克曼菌的丰度呈正相关，表明大鼠移动的距离越长，阿克曼菌的丰度越高。还检查了大鼠的起始体重及其与移动距离和阿克曼菌丰度的相关性。在强迫运动条件下，基线体重与阿克曼菌丰度之间存在显著的负相关。
讨论
肠道菌群在宿主能量稳态、代谢调节和免疫功能中发挥着基础性作用，而菌群失调越来越被认为是导致肥胖及相关代谢紊乱的核心因素。虽然饮食被广泛认为是肠道微生物组成的主要环境决定因素，但不同运动方式的独立和交互作用仍未得到充分了解。本研究证明，饮食和运动协同作用，而非层级作用，共同塑造了肠道微生物的多样性、组成和功能潜力。尽管高脂饮食主要决定了整体的微生物结构，但运动方式关键性地调节了具有明确代谢相关性的特定细菌类群的丰度。
α多样性反映了生态系统的丰富度和均匀度，通常被解释为肠道微生物健康的标志。研究结果表明，饮食和运动都显著影响了α多样性。值得注意的是，在所有运动条件下，高脂饮食与更高的微生物多样性、丰富度和均匀度相关。虽然这一发现似乎与将植物性、富含纤维的饮食与更高的多样性联系起来的研究相矛盾，但最近的证据表明，高脂饮食引起的多样性增加高度依赖于饮食成分，特别是膳食纤维含量。在高脂饮食条件下观察到的α多样性增加，可能反映了专门从事脂质代谢的细菌类群的增殖，因为高脂饮食创造了一个选择环境，有利于利用脂肪的细菌，同时减少了降解纤维的菌群。然而，关键的是，高脂饮食条件下观察到的多样性增加并不等同于肠道健康的改善。数据显示，在多样性增加的同时，变形菌门和潜在的致病菌也同时增加，这表明此处观察到的多样性升高反映的是菌群失调，而非健康、平衡的微生物组。这种分类学多样性与功能性微生物健康之间的区别很重要，因为有利于致病菌或机会性菌群的组成变化可能会驱动代谢功能障碍、系统性炎症和肠道-脑轴信号改变，尽管整体多样性似乎增加了。
运动对整体α多样性的影响比饮食的影响更为温和，这与系统性综述将饮食列为肠道菌群组成的主要环境调节因素的观点一致。然而，这种层级观点过于简化了在数据中观察到的复杂饮食-运动相互作用。在正常饲料条件下，自愿和强迫运动都适度增加了α多样性，其中强迫运动的影响更大。值得注意的是，自愿运动-正常饲料组在所有条件下表现出最低的多样性，考虑到运动通常会促进微生物健康，这似乎有悖常理。这一反直觉的发现可能反映了自愿运动作为实验模型的固有局限性。与提供标准化强度、持续时间和频率的强迫跑步机训练不同，自愿跑轮运动在个体动物之间的总距离、运动持续时间和节律模式方面差异很大。这种行为的异质性转化为不一致的生理刺激，包括可变的乳酸产生、不同的交感神经激活以及肠道转运时间的不同变化，导致微生物反应的高度个体间差异。这些发现强调，饮食和运动并非层级作用，而是协同作用共同塑造肠道微生物生态。虽然高脂饮食主要驱动了整体群落结构，但运动方式关键性地决定了特定功能类群，尤其是有益菌属的丰度，例如阿克曼菌仅在运动的高脂饮食组中出现。因此，运动效应高度依赖于背景，饮食组成和运动方式共同决定了微生物结果。
在门的水平上，四个门构成了核心微生物组：厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和脱铁杆菌门。厚壁菌门在所有组中占主导地位，反映了其在哺乳动物肠道生态系统中的基本作用。高脂饮食显著降低了厚壁菌的丰度，这可能是通过脂质专性门的竞争排斥作用，而运动对厚壁菌水平的影响最小，这与之前对大鼠的研究一致。拟杆菌门对于蛋白质和脂质分解代谢至关重要，其在自愿运动-正常饲料组中的丰度相比对照组-正常饲料组显著降低，但在高脂饮食组中保持稳定，这与高脂饮食导致拟杆菌减少的报道形成对比。厚壁菌与拟杆菌的比值曾被提议作为代谢健康的生物标志物，比值升高与肥胖相关。然而，有研究最终证明，由于与不同人群的关联不一致以及其他组成因素的混杂，这个比值缺乏诊断效用。我们的数据支持这一结论，因为厚壁菌/拟杆菌比值与代谢和体重结果对应性差。变形菌门，一个在菌群失调状态下富集的菌门，在高脂饮食组中显著增加，而在正常饲料组中极少存在，这与高脂饮食诱导革兰氏阴性兼性厌氧菌扩张的报道一致。最值得注意的是，疣微菌门，仅由嗜粘蛋白阿克曼菌代表，仅在运动的高脂饮食组中出现。这种依赖于运动的富集与表明体育活动相关阿克曼菌扩增的研究一致，并反映了该细菌利用运动诱导的代谢物同时赋予代谢益处（包括改善葡萄糖稳态和肠道屏障完整性）的能力。脱铁杆菌门的丰度在高脂饮食下也增加，与其和高脂喂养的关联一致。
在属和物种水平上，出现了不同的饮食-运动相互作用模式。正常饲料组的特点是乳杆菌属、动线菌属和艾森伯格菌属的丰度升高，这些属通常与富含纤维的饮食和碳水化合物发酵相关。具体来说，嗜木动线菌和沃氏肠杆菌在正常饲料喂养的动物中占主导地位，分别反映了它们在纤维降解和维持肠道屏障方面的作用。相比之下，高脂饮食组以消化球菌属和回肠罗姆布茨菌属为主，这与脂质丰富的微生物群落一致。值得注意的是，高脂饮食条件下的强迫运动促进了乳酸卢瑟尼杆菌和产硫磺硫酸还原孢菌的增长，这些是与有益于肠道健康的代谢物生产相关的发酵菌种，而自愿运动产生的分类学变化不太一致，这可能反映了个体动物间运动强度的可变性。
除了分类组成，饮食和运动之间的相互作用显著地塑造了功能相关的微生物属，特别是那些参与宿主代谢的属。短链脂肪酸（SCFAs）是微生物通过发酵膳食底物产生的代谢产物，在代谢调节、免疫调节和维持肠道屏障完整性中发挥核心作用。在本研究中，几种已确认的短链脂肪酸产生菌属，包括粪球菌属、丁酸球菌属、布劳特菌属、厌氧棍状菌属、颤螺旋菌科分类地位未定属和罗斯氏菌属，都受到饮食和运动的显著调节。虽然单独的高脂饮食增加了部分短链脂肪酸产生菌的丰度，但结构化运动，特别是高脂饮食条件下的强迫跑步机运动，引发了最显著的富集，强迫运动-高脂饮食组表现出这些类群的最高相对丰度。
功能类群分析揭示了运动-饮食协同作用如何塑造代谢相关类群。强迫运动-高脂饮食组显著富集了短链脂肪酸产生菌属，包括粪球菌属、布劳特菌属和罗斯氏菌属，这些都是通过产生丁酸盐和丙酸盐来增强肠道屏障完整性、免疫调节和代谢功能的细菌。布劳特菌通常与高纤维饮食相关，但在高脂饮食和运动条件下均有所增加，其中强迫运动产生的影响最大，这证实了先前的观察结果。与肠道屏障相关的属表现出不同的反应。乳杆菌属通常对纤维有反应，但在高脂饮食和运动条件下均显著减少，这与多项研究报告运动相关的乳杆菌减少一致。而阿克曼菌属和多雷阿菌属仅在运动的高脂饮食组中增加。最关键的是，强迫运动减轻了高脂饮食诱导的致病菌富集，潜在的致病菌在强迫运动-高脂饮食组中，相比对照组-高脂饮食组和自愿运动-高脂饮食组显著减少。这表明结构化运动促进了一种保护性的微生物特征，能够部分补偿饮食诱导的菌群失调。
嗜粘蛋白阿克曼菌成为运动-饮食相互作用的关键生物标志物。这种属于疣微菌门的粘蛋白降解菌仅出现在运动的高脂饮食组中，表明在代谢挑战性饮食条件下存在运动依赖性的富集。阿克曼菌通过粘蛋白衍生代谢物的产生，赋予多种代谢益处，包括改善葡萄糖稳态、增强肠道屏障完整性和抗炎作用。研究结果与大量在动物模型和人类运动员中记录运动诱导阿克曼菌扩增的研究一致。关键的是，我们观察到了剂量-效应关系：强迫运动的距离与阿克曼菌丰度呈正相关，而基线体重与阿克曼菌丰度呈负相关，这表明阿克曼菌可能是结构化运动、代谢状态和体重调节之间潜在的联系介质。这些发现表明，运动强度，而非仅仅是自愿活动，是
