《International Journal of Molecular Sciences》：Potential of Zinc-L-Selenomethionine to Improve the Health of Weaned Piglets and Its Antioxidant Stress Mechanism Through Modulation of PI3K/AKT and Nrf2/Keap1 Signaling Pathways
Shujie Liu,
Yongming Li,
Xin Tao,
Siyuan Li,
Jie Wu,
Fei Ji,
Ziwei Xu and
Bo Deng
引言：断奶应激与硒营养的新策略
早期断奶是仔猪生命中最具应激性的事件之一。断奶后，仔猪需适应剧烈的社会、环境和日粮变化，而此时其消化和免疫系统尚未发育成熟。这种突然的转变破坏了生理稳态，导致活性氧（ROS）过度产生，进而引发肠道损伤、免疫功能障碍、内分泌紊乱，并严重扰乱机体氧化-抗氧化系统的平衡。其后果是降低饲料效率、增加腹泻率、阻碍生长，并提高仔猪的发病率和死亡率。断奶应激对生理功能的负面影响甚至可能持续到成年。因此，开发有效的营养策略以改善断奶仔猪的健康和抗应激能力，始终是研究的关键领域。
硒是人和动物生长发育必需的微量元素，在多种生化和生理过程中扮演着至关重要的角色，包括增强抗氧化防御、提高免疫力、维持代谢稳态、促进生长和改善繁殖性能。硒主要通过以硒代半胱氨酸形式整合到硒蛋白中来发挥其生物学功能。一些重要的硒蛋白，如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、碘甲腺原氨酸脱碘酶和甲状腺素脱碘酶，是机体抗氧化防御系统的关键组成部分。然而，硒缺乏可能导致多种疾病，而摄入过量则会引起硒中毒。因此，维持适宜的硒摄入量对维持人和动物的健康至关重要。
硒的生物活性不仅取决于摄入量，还显著受其化学形态的影响。有机硒因其更高的吸收率、更好的生物活性和更低的毒性而受到更多关注。在动物营养中，商业有机硒源通常以硒代蛋氨酸形式提供。然而，合成的硒代氨基酸水溶性低，其晶体表现出疏水性，导致溶解速率慢，这无疑降低了其在动物体内的生物利用度。因此，开发具有更优特性的新型硒代蛋氨酸衍生物具有积极意义。
锌-L-硒代蛋氨酸是一种通过氨基酸与必需金属1:1络合形成的新型有机硒源，其含有约63.6%的L-硒代蛋氨酸和20%的锌。其主要优势在于锌通过提高L-硒代蛋氨酸的溶解度及抗肠道微生物降解能力，从而增强了L-硒代蛋氨酸的生物利用度。现有研究表明，与亚硒酸钠相比，饲粮中添加Zn-L-SeMet可增加肉鸡和蛋鸡组织及鸡蛋中的硒沉积，增强肉鸡胸肌中GSH-Px活性并减少胸肌收缩损失。此外，在生长育肥猪和羔羊中，与亚硒酸钠或L-硒代蛋氨酸相比，饲粮添加Zn-L-SeMet改善了生长性能，增加了某些组织中的硒沉积，并提高了血浆和某些组织中的GSH-Px活性。然而，仍需进一步研究以探索Zn-L-SeMet的效果，特别是在不同生理阶段猪及其他动物物种上的应用。
Zn-L-SeMet在减轻氧化应激损伤方面具有巨大潜力，但尚无研究专门考察其对断奶仔猪断奶应激和健康状况的影响。因此，本研究首次全面评估了Zn-L-SeMet作为断奶仔猪饲料添加剂的效果，考察了其对生长性能、抗氧化应激和免疫功能、甲状腺激素状态及硒蛋白表达的影响，同时确定了仔猪的最佳饲粮添加量。此外，本研究利用过氧化氢处理的猪肠上皮细胞（IPEC-J2）探讨了Zn-L-SeMet对抗氧化应激的潜在分子机制，为Zn-L-SeMet在断奶动物护理中的应用提供了理论基础和实践指导。
结果：
1. Zn-L-SeMet对断奶仔猪生长性能的影响
生长性能结果显示，在试验第0-14天，与对照组相比，添加Zn-L-SeMet的四个处理组（GI, GII, GIII, GIV）的平均日增重显著增加了约21.43%、25.00%、14.29%和14.29%。Zn-L-SeMet添加水平与第42天体重的回归分析呈现显著的二次关系，与第0-42天平均日增重、以及第0-42天料重比同样存在显著的二次关系，峰值均出现在0.2 mg Se/kg的添加剂量。这些结果表明，饲粮中添加Zn-L-SeMet可在一定程度上改善断奶仔猪的生长性能，其中0.2 mg Se/kg是最有效的添加水平。
2. Zn-L-SeMet对断奶仔猪抗氧化能力的影响
在第42天，与对照组相比，添加0.1、0.2、0.3 mg Se/kg Zn-L-SeMet组的仔猪血清GSH-Px活性显著更高，其中GII组的GSH-Px活性最高。此外，血清GSH-Px活性随Zn-L-SeMet添加水平的升高呈二次曲线增加。所有添加组的血清超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组，其中GII组的SOD活性最高，显著超过其他处理组。血清过氧化氢酶活性在GII组最高，显著高于CON、GI和GIV组。值得注意的是，GIV组的CAT活性显著低于CON组，且CAT活性随Zn-L-SeMet添加水平的升高呈现二次关系。血清丙二醛浓度在GII组显著低于CON组。这些结果表明，Zn-L-SeMet改善了断奶仔猪的抗氧化能力，其中0.2 mg Se/kg是最有效的添加水平。
3. Zn-L-SeMet对断奶仔猪血清免疫球蛋白和甲状腺激素浓度的影响
在第42天，GII组血清免疫球蛋白G浓度显著高于CON、GI和GIV组。同样，GIII组的IgG浓度也显著高于CON和GIV组。Zn-L-SeMet添加显著提高了GI、GII和GIII组的血清免疫球蛋白M浓度，其中GII组显示出所有组中最高的IgM浓度。此外，IgM浓度随Zn-L-SeMet添加水平的升高呈现二次变化。0.2 mg Se/kg Zn-L-SeMet产生了最高的IgM和IgG浓度。五个处理组之间的血清免疫球蛋白A浓度无显著差异。
在第42天，添加Zn-L-SeMet的断奶仔猪血清三碘甲腺原氨酸和甲状腺素浓度表现出相似的趋势。在五个处理组中，血清T3和T4浓度在GII组最高，显著超过CON、GI和GIV组，而GII和GIII组之间无显著差异。此外，GIII组的血清T4浓度显著高于CON和GIV组。甲状腺激素代谢的最佳浓度是0.2 mg Se/kg Zn-L-SeMet。
4. Zn-L-SeMet对断奶仔猪肝脏硒蛋白基因表达的影响
在第42天，与CON和GIII组相比，GII组肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶1、碘甲腺原氨酸脱碘酶1、硫氧还蛋白还原酶1、硒磷酸合成酶2和硒蛋白P的mRNA表达水平显著增加。与CON组相比，GIII组GSH-Px1、TrxR1和SelP的mRNA表达水平显著升高。
5. Zn-L-SeMet和H2O2对IPEC-J2细胞活力的影响
为探究Zn-L-SeMet的抗氧化应激机制，建立了H2O2诱导的IPEC-J2细胞氧化应激模型。通过评估细胞活力确定了Zn-L-SeMet对IPEC-J2细胞的安全浓度。当单独用Zn-L-SeMet处理6小时时，IPEC-J2细胞的活力随着Zn-L-SeMet浓度的升高而增加，在1.5–9.0 μmol Se/mL时达到显著水平。对于处理12、24或48小时的情况，细胞活力在0.1–6.0 μmol Se/mL浓度下显著改善，而在9.0 μmol Se/mL时显著下降。因此，Zn-L-SeMet对IPEC-J2细胞的安全浓度在6小时处理中高达9.0 μmol Se/mL，在12-48小时处理中高达6.0 μmol Se/mL。值得注意的是，Zn-L-SeMet增强了细胞活力，在用1.0 μmol Se/mL处理24小时时达到峰值136.33%。
为建立细胞氧化应激模型，将IPEC-J2细胞暴露于不同浓度的H2O2中不同时间，随后评估细胞活力。活力随着H2O2浓度或处理时间的增加而显著下降。当IPEC-J2细胞经受0.3 mM H2O2处理6小时，细胞活力降至约65%。因此，0.3 mM H2O2处理6小时被确定为诱导细胞氧化应激的适宜条件。
接下来，评估了Zn-L-SeMet对0.3 mM H2O2诱导的IPEC-J2细胞活力下降的影响。与仅暴露于H2O2的细胞相比，添加0.5–6.0 μmol Se/mL浓度的Zn-L-SeMet显著减轻了H2O2诱导的细胞活力下降。在1.0 μmol Se/mL的Zn-L-SeMet下观察到最高的细胞活力，约为114.92%。然而，随着浓度从1.0增加到6.0 μmol Se/mL，细胞活力下降。这些结果表明，当IPEC-J2细胞暴露于H2O2时，Zn-L-SeMet也以剂量依赖的方式显著改善细胞活力。
6. Zn-L-SeMet对暴露于H2O2的IPEC-J2细胞凋亡的影响
在氧化应激条件下分析了Zn-L-SeMet的保护作用及其最佳浓度。在对照组和H2O2组中观察到椭圆形细胞群，而在Zn-L-SeMet组中观察到三角形细胞群，这反映了Zn-L-SeMet对H2O2诱导的细胞凋亡的细胞保护作用。此外，仅暴露于H2O2的IPEC-J2细胞显示出凋亡细胞百分比显著增加，与未接受任何处理的细胞相比高出约3倍。然而，添加Zn-L-SeMet（1.0、1.5和3.0 μmol Se/mL）显著降低了细胞凋亡。在测试浓度中，1.0 μmol Se/mL显示出最大的保护作用，导致最低的凋亡细胞百分比。这些发现表明，Zn-L-SeMet以剂量依赖的方式有效减少H2O2诱导的细胞凋亡，其中1.0 μmol Se/mL是最有效的保护浓度。
7. Zn-L-SeMet对暴露于H2O2的IPEC-J2细胞抗氧化能力的影响
本研究通过将IPEC-J2细胞暴露于H2O2进一步研究了Zn-L-SeMet的抗氧化能力。与未处理细胞相比，单独暴露于H2O2显著增加了细胞内ROS水平和乳酸脱氢酶释放。相反，用Zn-L-SeMet处理显著减弱了H2O2诱导的这些标记物的增加，其中1.0 μmol Se/mL组的ROS水平和LDH释放最低。
IPEC-J2细胞单独暴露于H2O2导致GSH-Px、SOD和CAT的活性显著降低，MDA浓度增加。然而，用Zn-L-SeMet处理显著增强了SOD、GSH-Px和CAT的活性，同时降低了MDA浓度，表现出明显的剂量依赖性模式；1.0 μmol Se/mL对这些指标提供了最显著的改善。
8. Zn-L-SeMet通过激活Nrf2/Keap1和PI3K/AKT信号通路减轻H2O2诱导的氧化应激
Nrf2/Keap1通路对于维持细胞稳态至关重要。IPEC-J2细胞单独暴露于H2O2显著提高了核因子E2相关因子2的mRNA和蛋白表达水平，同时降低了Kelch样ECH相关蛋白1、NAD(P)H醌氧化还原酶-1、血红素加氧酶-1的mRNA和蛋白表达水平，以及抗氧化反应元件的mRNA表达水平、p-Nrf2的蛋白表达水平和p-Nrf2/Nrf2的蛋白比率。相反，添加Zn-L-SeMet显著增加了Keap1、NQO1和HO-1的mRNA和蛋白表达水平，ARE的mRNA表达水平，p-Nrf2的蛋白表达水平，以及p-Nrf2/Nrf2的蛋白比率，同时降低了Nrf2的mRNA和蛋白表达水平。这些发现表明，Zn-L-SeMet通过激活Nrf2/Keap1通路有效抵消H2O2诱导的氧化应激。
PI3K/AKT信号通路是调节细胞增殖和凋亡不可或缺的。当IPEC-J2细胞单独暴露于H2O2时，PI3K和AKT的mRNA和蛋白表达水平显著增加，同时p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平以及p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的蛋白比率降低。Zn-L-SeMet处理显著提高了p-AKT和p-PI3K的蛋白表达水平以及p-AKT/AKT、pPI3K/PI3K的蛋白比率，同时降低了AKT和PI3K的mRNA和蛋白表达水平。Zn-L-SeMet通过激活PI3K/AKT信号通路显示出针对H2O2诱导的氧化应激的细胞保护作用，这与其增强细胞活力和防止凋亡的能力相一致。
讨论：
硒是维持动物代谢稳态、减轻氧化应激和促进健康生长的必需元素。本研究结果与先前报告一致，表明饲粮中添加Zn-L-SeMet可在一定程度上改善断奶仔猪的生长性能。观察到的显著二次关系证实，为断奶仔猪补充适当剂量的Zn-L-SeMet可获得最佳生长性能。本研究表明，0.2 mg Se/kg Zn-L-SeMet可为断奶仔猪带来最佳生长性能，该值低于NRC的推荐值。
硒的主要生物学功能是其抗氧化能力。在本研究中，饲粮中添加0.1–0.3 mg/kg Zn-L-SeMet显著提高了仔猪血清GSH-Px和SOD活性。此外，0.2 mg Se/kg Zn-L-SeMet显著增加了血清CAT活性并降低了MDA水平。这些结果表明，Zn-L-SeMet具有强大的抗氧化特性，并增强了断奶仔猪的抗氧化能力，从而有益于生长性能。此外，在饲粮Zn-L-SeMet水平与GSH-Px和CAT活性之间观察到显著的二次关系，表明断奶仔猪的抗氧化功能随饲粮Zn-L-SeMet水平呈剂量依赖性变化。超出最佳范围，更高水平的Zn-L-SeMet不会进一步增强抗氧化功能，甚至可能削弱有益效果。作为一种新型硒源，Zn-L-SeMet有效增强了断奶仔猪的抗氧化能力，其中0.2 mg Se/kg是最有效的添加水平。
早期断奶与因断奶应激和免疫系统不成熟导致的免疫力受损有关。除抗氧化作用外，硒在调节免疫系统方面也至关重要。在本研究中，饲粮添加0.1–0.3 mg Se/kg Zn-L-SeMet以剂量依赖的方式增加了血清IgG和IgM浓度。IgM浓度也随着Zn-L-SeMet添加水平的升高呈现二次响应，其中0.2 mg Se/kg的Zn-L-SeMet产生了最高的IgM和IgG水平。这些发现表明，Zn-L-SeMet通过改善体液免疫应答来增强免疫功能。
硒也是甲状腺激素合成和代谢必需的微量营养素。在本研究中，饲粮添加Zn-L-SeMet同时增加了T3和T4的血清浓度，而未改变T4/T3比值。我们的结果可归因于增强的DIO1活性，这促进了T4向T3的转化，这一点通过Zn-L-SeMet补充后肝脏DIO1 mRNA表达水平的显著增加得到证明。此外，Zn-L-SeMet可能保护甲状腺免受应激诱导的损伤，从而可能促进T4分泌并提高其水平。这些发现表明，Zn-L-SeMet具有高生物活性，并在断奶应激期间对甲状腺激素代谢产生有益影响。增强的甲状腺活性可以促进蛋白质合成和能量产生，从而改善生长性能。这些结果与上述发现一致，表明0.2 mg Se/kg Zn-L-SeMet是最佳补充剂量。
硒的生物学功能主要通过其以硒代半胱氨酸形式整合到硒蛋白中来实现。在本研究中，饲粮添加0.2 mg Se/kg Zn-L-SeMet显著增强了肝脏硒蛋白的mRNA表达，这与断奶仔猪功能的改善相关。相比之下，0.3 mg Se/kg Zn-L-SeMet仅增加了TrxR1和SelP的表达水平，且低于0.2 mg Se/kg Zn-L-SeMet所观察到的水平。这表明Zn-L-SeMet主要通过促进硒蛋白基因的合成和表达来发挥其抗氧化功能。此外，硒蛋白基因的表达受饲粮Zn-L-SeMet水平的调节，证明了硒蛋白对过量硒的抗性和层次性。
肠道是硒吸收的主要部位，也是仔猪断奶应激的主要靶点。过氧化氢是主要的ROS之一，被用作许多不同类型细胞中氧化应激的诱导剂。鉴于此，我们利用H2O2诱导的IPEC-J2细胞氧化损伤模型进一步研究了Zn-L-SeMet发挥抗氧化作用的机制。在我们的研究中，H2O2暴露诱导了IPEC-J2细胞的氧化损伤和凋亡，并降低了活力。这伴随着ROS和MDA产生的增加、LDH释放的升高以及抗氧化酶活性的降低。相反，Zn-L-SeMet有效保护了IPEC-J2细胞免受这种氧化损伤。它显著抵消了H2O2诱导的ROS和MDA产生的增加，减少了LDH释放，并恢复了SOD、GSH-Px和CAT的活性，也显示出显著的剂量依赖性模式。此外，Zn-L-SeMet抑制了IPEC-J2细胞的凋亡，同时促进了细胞增殖。本研究中使用的Zn-L-SeMet是一种新的硒代蛋氨酸衍生物，由L-硒代蛋氨酸与锌螯合形成，其中锌取代了L-硒代蛋氨酸末端羧基中的氢原子，并与该碳原子上的氨基形成键，从而形成环状结构。与硒代蛋氨酸的链状结构相比，Zn-L-SeMet的环状结构可以防止L-硒代蛋氨酸与其他物质形成复合物，因此更稳定，从而提高了其溶解度和生物利用度。在本研究中，Zn-L-SeMet可以被IPEC-J2细胞更有效地摄取，并主要代谢为L-硒代蛋氨酸形式，后者被整合到抗氧化系统的一些重要硒蛋白中，特别是GSH-Px，以参与对抗氧化应激并促进细胞活力。该结果进一步突出了Zn-L-SeMet在体外的强大抗氧化和自由基清除能力，这与体内仔猪实验的结果一致。
Nrf2/Keap1通路是一种关键的防御机制，受多种因素调节以对抗不同类型的氧化应激并维持细胞稳态。在这项研究中，H2O2诱导的氧化应激通过抑制Nrf2/Keap1通路，抑制了Nrf2磷酸化，降低了p-Nrf2/Nrf2比率、关键通路基因和蛋白的表达水平以及下游抗氧化酶的活性。然而，Zn-L-SeMet处理促进了Nrf2蛋白磷酸化，增加了p-Nrf2/Nrf2比率，上调了ARE的mRNA表达水平，增强了Keap1、NQO1和HO-1的mRNA和蛋白表达水平，并进一步激活了下游抗氧化酶，表明Nrf2/Keap1通路被激活。最近的研究表明，Nrf2在Ser40位点的磷酸化促进其从Nrf2/Keap1复合物中释放，导致Nrf2积累和核转位，随后激活ARE相关基因。在这项研究中，我们的结果表明Zn-L-SeMet可能增强Nrf2在Ser40位点的磷酸化，诱导核转位，并激活该通路的关键基因或蛋白，通过刺激Nrf2/Keap1-ARE通路保护IPEC-J2细胞免受氧化应激损伤。
PI3K/AKT通路在调节各种生物过程中起着关键作用，包括细胞增殖、凋亡、分化和对氧化应激的反应。在过量的细胞内ROS存在下，它可能被抑制。该通路被认为是Nrf2上游激活或核转位的关键调节因子，促进Nrf2介导的抗氧化和II相解毒酶的表达。在本研究中，IPEC-J2细胞暴露于H2O2导致p-AKT和p-PI3K的蛋白表达水平降低，以及p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K的比率降低，表明H2O2通过抑制PI3K/AKT通路引发了细胞应激和凋亡。然而，Zn-L-SeMet处理增加了pAKT和pPI3K的蛋白表达水平，并提高了p-AKT/AKT和pPI3K/PI3K的比率，表明激活了PI3K/AKT通路，该通路调节细胞保护和抗氧化过程。这一观察结果与Zn-L-SeMet处理后观察到的pNrf2蛋白水平、Nrf2/Keap1通路基因或蛋白水平以及细胞活力的增加相一致。然而，PI3K/AKT通路如何精确激活Nrf2并调节抗氧化解毒基因的表达，还需要进一步研究。
结论：
综上所述，Zn-L-SeMet改善了断奶仔猪的生长性能，提高了甲状腺激素水平，并促进了肝脏硒蛋白基因的表达。此外，它增强了抗氧化能力和免疫功能，从而有助于抵抗断奶应激。体外检查进一步证明，Zn-L-SeMet有效清除细胞内ROS，促进细胞存活，并防止凋亡，为IPEC-J2细胞抵抗H2O2诱导的氧化损伤提供了强有力的保护。这种保护机制可能与PI3K/AKT和Nrf2/Keap1通路的激活密切相关。鉴于其强大的抗氧化特性，Zn-L-SeMet是断奶仔猪的优秀硒源。推荐的饲粮添加水平为0.2 mg Se/kg。
