《International Journal of Molecular Sciences》：Traditional Korean Doenjang Restores Splenic and NK Cell Function in Cyclophosphamide-Induced Immunosuppressed Rats
Hak Yong Lee,
Young Mi Park,
Dong Yeop Shin,
Hai Min Hwang,
Sung Hak Chun,
Sang Jin Lim,
Hee-Jong Yang,
Gwang Su Ha,
Myeong Seon Ryu and
Jae Gon Kim
+ 3 authors
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本研究通过动物实验评估了韩国四种地域性传统大酱对环磷酰胺（CP）诱导的免疫抑制大鼠模型的免疫调节作用。研究发现，连续四周的大酱摄入可有效恢复脾脏指数、改善血液学参数、提升脾细胞增殖与NK细胞活性，并提高血清中白细胞介素（IL）-2、IL-12、干扰素（IFN）-γ及免疫球蛋白G（IgG）水平。机制研究表明，大酱可恢复被抑制的丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）/核因子κB（NF-κB）信号通路的磷酸化水平，并改善脾脏组织结构。结果表明，不同地域的大酱品种均能有效缓解CP诱导的免疫功能障碍，具备作为功能性膳食干预手段的潜力。
1. 引言
大酱（Doenjang）是一种在韩国已有数百年食用历史的传统发酵大豆酱，既是蛋白质来源，也是调味剂。其制作工艺与日本味噌（Miso）、印尼丹贝（Tempeh）相似，通过大豆砖块“Meju”在盐水中发酵而成。在此过程中，大豆蛋白质被水解为有机酸、氨基酸、矿物质、多肽等多种生物活性物质，这一转化主要由曲霉（Aspergillus）属和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等有益微生物完成。研究表明，大酱富含酚类化合物和生物活性肽，具备抗氧化、抗肥胖、抗癌等多种生物活性，尤其是对降低“坏”胆固醇（低密度脂蛋白胆固醇，LDL-c）有益，因此正日益被视为一种功能性发酵食品。然而，大酱的免疫调节作用此前尚未明确。本研究旨在评估在免疫抑制条件下，摄入大酱能否调节免疫功能。研究采用环磷酰胺（CP）诱导的免疫抑制大鼠模型，通过为期四周的大酱补充，观察关键免疫指标的变化，以确定其恢复或增强免疫应答的潜力。
2. 结果
2.1. 大酱的高效液相色谱（HPLC）分析
对四个地区大酱样品（S1-S4）的异黄酮含量进行了比较分析。结果显示，总异黄酮含量在S4（固城郡）样品中最高，达72.07 ± 0.69 mg/100 g，显著高于S1-S3样品。S2（牙山市）的总异黄酮含量（44.67 ± 1.71 mg/100 g）也高于S1和S3。大豆苷元（Daidzein）含量在S4中最高，而大豆苷（Daidzin）仅在S1中被检测到。染料木黄酮（Genistein）在S1和S3中含量较低，在S2和S4中未检出。相比之下，黄豆黄素（Glycitein）在四个样品中均有检出，且在S4中含量显著更高。这些结果表明，不同来源大酱的异黄酮组成和含量存在显著差异，这很可能反映了发酵特性的不同。
2.2. 体重与免疫相关组织重量
环磷酰胺（CP）是一种属于氮芥类的烷化剂，具有免疫抑制作用，常用于治疗多种癌症。它会抑制免疫细胞，对免疫系统产生负面影响，并常导致体重（BW）下降。在本研究中，实验期间每周测量一次体重。结果显示，与正常组相比，CP处理组（模型组及各剂量组）的体重显著下降，体现了其免疫抑制效应。然而，无论是给予大酱还是阳性对照药HemoHIM，均未观察到体重的显著增加。这表明这些干预措施未能缓解CP引起的体重下降。解剖后测量了胸腺和脾脏重量。结果显示，被CP抑制的胸腺重量在S3组中显著增加，S4组也呈上升趋势。类似地，所有大酱处理组的脾脏重量均有增加趋势，但仅有S3组呈现出显著增加。这些结果表明，摄入大酱不影响体重，但可增加脾脏重量，从而可能影响脾脏相关的免疫功能。
2.3. 全血细胞计数（CBC）
在免疫抑制状态下，白细胞（WBC）组成的变化是免疫状态的重要指标。白细胞总数的减少通常反映了造血活性被抑制和整体免疫能力的下降。解剖后立即进行了全血细胞计数分析。结果显示，总白细胞计数在S2组中有不显著增加，而其他所有大酱补充组均出现显著增加。淋巴细胞计数在S3组中显著升高。中性粒细胞计数在所有组中均有增加，其中S1和S4组的增加具有统计学显著性。嗜酸性粒细胞计数未见变化。单核细胞水平在S3组与CP处理组（模型组）相当，S1和S2组未见显著增加，但在S4组中观察到单核细胞计数显著升高。总体来看，这些结果表明大酱摄入增强了免疫细胞群，特别是总白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞的数量，其中S4组表现出最一致的免疫增强效果。
2.4. 脾细胞增殖与脾脏自然杀伤（NK）细胞活性
脾细胞增殖和自然杀伤（NK）细胞活性的增加，表明在免疫抑制条件下，适应性免疫和先天免疫功能均得到恢复，意味着整体免疫功能的增强。为评估传统大酱对CP诱导免疫抑制大鼠脾细胞增殖的影响，研究评估了体液免疫（LPS诱导）和细胞免疫（ConA诱导）反应。结果显示，与正常组相比，CP处理显著降低了脂多糖（LPS）处理的脾细胞增殖，而所有S1-S4组的增殖均有所增加。尽管S2和S3组未显示出统计学上的显著差异，但其增殖相对于CP处理组（模型组）仍有增加。在伴刀豆球蛋白A（ConA）处理的脾细胞中，所有大酱处理组相对于CP处理组（模型组）的增殖均显著增加。这些结果表明，在CP诱导的免疫抑制下，传统大酱摄入可恢复脾细胞在体液和细胞免疫应答中的增殖能力。此外，与CP处理组相比，大酱摄入也增加了脾脏NK细胞的活性。这表明大酱可能具有免疫调节作用，有助于恢复整体免疫功能。
2.5. 血清细胞因子与免疫球蛋白G（IgG）水平
免疫状态可通过评估血清细胞因子（白细胞介素（IL）-2、IL-12、干扰素（IFN）-γ）和免疫球蛋白G（IgG）水平来判断。先前研究报道CP会降低这些免疫标志物的水平。本研究检查了大酱对血清IL-2、IL-12、IFN-γ和IgG水平的影响。结果显示，与正常组相比，CP处理组的IL-2、IL-12和IFN-γ水平显著降低。摄入大酱（S1-S4）或阳性药HemoHim改善了这种降低，其中S2和S4组呈现恢复趋势，而大酱（S1和S3）及HemoHim处理组与CP组相比有显著增加。IgG水平在CP处理组中降低，而所有大酱处理组（S1-S4）和HemoHim处理组的血清IgG水平均得到显著恢复。这些结果表明，大酱通过恢复细胞因子分泌和IgG产生，有效缓解了CP诱导的免疫抑制。
2.6. 脾脏中的MAPKs/NF-κB通路
为探究大酱摄入是否调节免疫相关信号通路，研究首先检测了脾脏中丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs，包括Erk、JNK、p38）和核因子κB（NF-κB）通路的磷酸化水平。这些通路磷酸化的降低是免疫抑制的一个公认指标。结果显示，在CP处理组中，MAPKs和NF-κB的磷酸化水平相比未处理组（正常组）均显著降低。然而，为期四周的大酱补充有效地将这些信号通路的磷酸化恢复到了与未处理组相当的水平。这些发现表明，四周的大酱摄入有效恢复了免疫相关信号通路的激活水平。
2.7. 脾脏组织学分析
CP会导致严重的脾脏损伤。本研究探讨了大酱摄入能否改善CP诱导的脾脏损伤的组织学变化。CP处理四周导致了严重的脾脏损伤，包括白髓萎缩、边缘区（MZ）塌陷和淋巴细胞耗竭。相比之下，大酱处理组的组织学特征与CP处理组相比有所改善。S2组显示出轻微的红髓浓缩但无白髓萎缩，而S1、S3和S4组则表现出红髓浓缩减轻、白髓萎缩减少以及更清晰的MZ结构。阳性药组也显示出红髓和白髓的明显分离，细胞浓缩显著减少。在大酱组中，S3和S4组的改善效果与阳性药组最为接近。这些发现表明，大酱可能通过改善脾脏结构的完整性，对CP诱导的免疫抑制发挥保护作用。
3. 讨论
免疫抑制可由多种病理和环境因素引起，包括营养不良、衰老、慢性疾病、感染以及免疫抑制剂（如CP）的使用。CP诱导的免疫抑制是一种具有临床意义的状况，其特征是先天性和适应性免疫系统均受到严重损害。为预防免疫抑制和促进免疫能力，维持适当的营养状态至关重要。鉴于临床上对在免疫抑制治疗期间保持免疫能力支持策略的需求日益增长，寻找安全且营养易得的免疫调节干预措施是一个重要的研究重点。本研究旨在确定传统发酵大酱能否在CP诱导的免疫抑制大鼠模型中恢复系统性免疫功能。研究结果不仅显示了大酱在恢复免疫器官质量、循环白细胞亚群正常化、辅助性T细胞1（Th1）相关细胞因子产生恢复、脾脏NK细胞活性增强以及MAPKs/NF-κB信号通路重新激活等方面的协同作用，还表明发酵大酱有助于在免疫抑制条件下重建功能性免疫能力。
大豆发酵过程会产生多种生物活性化合物，包括异黄酮苷元、多肽和抗氧化代谢物，这些物质可能具有免疫调节作用。研究表明，异黄酮可调节细胞因子分泌、增强NK细胞活性，并在多种细胞系统中调节炎症信号传导。本研究数据表明，摄入大酱可恢复白细胞群，并提高IL-2、IL-12和IFN-γ水平，这反映了对细胞毒性T细胞和巨噬细胞介导的宿主防御至关重要的Th1驱动的细胞免疫轴被重新激活。同时，血清IgG的增加进一步提示体液免疫的恢复，意味着B细胞功能和适应性免疫反应性的部分正常化。
脾脏在协调全身免疫反应中起着核心作用，CP诱导的脾脏结构破坏与淋巴细胞增殖受损和宿主防御能力下降密切相关。本研究中，大酱摄入与脾脏形态恢复、脾细胞对LPS和ConA刺激的增殖反应增强以及NK细胞细胞毒性活性增加相关。这些发现表明先天性和适应性免疫功能均得到恢复。此外，脾脏组织中MAPKs和NF-κB信号通路的激活，提示了对细胞因子产生、免疫细胞成熟和协调免疫激活至关重要的细胞内信号网络的重新参与。重要的是，这种信号通路的恢复与组织学的正常化同步发生，支持了脾脏免疫恢复中结构与功能耦合的概念。
本研究的一个关键考虑是，这种免疫恢复是否会干扰CP的化疗疗效。CP主要通过DNA烷基化和对快速增殖细胞的细胞毒性发挥其主要抗肿瘤作用。目前的研究是在非荷瘤模型中进行的，并特别关注免疫组织的恢复。因此，关于大酱对CP抗肿瘤活性潜在影响尚无法得出直接结论。然而，观察到的效应仅限于免疫及免疫相关组织，且表现为正常化而非过度的免疫激活。因此，研究结果提示的是支持性的免疫恢复，而非针对CP的广泛细胞保护作用。未来的研究需要采用荷瘤模型来确定膳食大酱是否影响CP的治疗指数。
从转化角度看，大酱与标准化草药配方（如HemoHIM）有根本区别。大酱是韩国饮食中经常食用的传统食物成分，这使其成为一种实用且易获得的基于食物的免疫调节策略，而非药物干预。因此，本研究的意义不仅在于证明了其免疫恢复效果可与已建立的草药产品相媲美，还在于为传统发酵食品作为功能性膳食资源的免疫学价值提供了科学证据。
研究也存在一些局限性。首先，未分离或量化产生观察到的免疫学效应的活性成分。其次，研究采用了急性CP诱导的免疫抑制模型，未在慢性或荷瘤条件下进行评估。第三，未直接评估大酱与CP之间的药效学相互作用。未来需要通过成分特异性分析、机制剖析和转化研究来解决这些局限性，以明确大酱的长期免疫调节作用和临床相关性。
4. 结论
传统发酵大酱通过协同恢复免疫细胞群、细胞因子平衡、脾脏结构和细胞内信号通路，显著恢复了CP诱导的免疫抑制大鼠的全身免疫能力。这些发现支持了食物基发酵产品可作为辅助营养策略来减轻免疫抑制和促进免疫稳态的观点。为进一步确定其活性成分并评估其临床适用性，有必要开展更深入的机制和转化研究。
