《Cancers》：Integrative In Silico mRNA–miRNA Profiling of mTOR Pathway Dysregulation in High-Grade Serous Ovarian Carcinoma
Radwa Hablase,
Cristina Sisu,
Emmanouil Karteris and
Jayanta Chatterjee
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本研究整合转录组学与miRNA测序数据，对mTOR（雷帕霉素机制靶点）通路在高侵袭性的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）中的失调进行了系统性分析。研究不仅发现了通路核心（mTORC1激活与mTORC2抑制）的转录重编程特征，更关键地揭示了let-7 miRNA家族（如let-7a-5p, let-7c-5p, let-7f-5p）通过协同调控FNIP1、RICTOR等关键节点，驱动mTORC1与自噬双重激活，从而促进肿瘤在代谢压力下存活的潜在机制。这为HGSOC的靶向治疗提供了新的理论视角和潜在生物标志物。
高级别浆液性卵巢癌中mTOR通路失调的整合性生物信息学分析：从转录重编程到miRNA网络调控
引言与背景
高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是最常见且最具侵袭性的卵巢癌亚型，以预后不良、晚期诊断和化疗耐药著称。mTOR通路是调控细胞生长、代谢和自噬的关键信号网络，在约55%的上皮性卵巢癌中存在失调，是一个有吸引力的治疗靶点。尽管已有mTOR抑制剂进入临床试验，但疗效有限，提示需要深入理解该通路在HGSOC中的具体失调机制。本研究旨在通过对原发、未接受过化疗的HGSOC样本进行整合性的mRNA和miRNA分析，全面描绘mTOR通路的转录和转录后调控图谱。
材料与方法
研究团队从TCGA（癌症基因组图谱）获取了100个HGSOC样本，并从GTEx（基因型-组织表达）数据库获取了80个正常卵巢组织样本。数据处理与分析流程包括：从UCSC Xena浏览器下载标准化的基因表达矩阵；利用SVA（替代变量分析）包的ComBat_seq函数对来自不同测序平台的miRNA数据进行批次效应校正。转录组差异基因表达分析使用LIMMA包进行，而miRNA差异表达分析则采用DESeq2包，显著性阈值设定为调整后p值<0.05且|log2FC|>0.5。差异表达基因随后与KEGG mTOR信号通路基因集进行比对，以识别通路特异性失调基因。通过miRDB、TargetScan、miRanda和DIANA-microT等多个数据库预测差异表达miRNA的靶基因，并筛选出在多数据库中得到验证的miRNA-mTOR基因对，利用Cytoscape软件构建调控网络，并通过度中心性分析识别网络枢纽节点。最后，对枢纽基因进行T-SNE降维分析和总生存（OS）的Kaplan-Meier生存分析。整个研究流程如图1所示：
结果
3.1. mTOR通路在高级别浆液性卵巢癌中的转录组学分析：通路层面剖析
对mRNA数据的分析显示，在HGSOC与正常组织的58,581个表达基因中，共有22,811个基因存在显著差异表达。其中，12,802个基因上调，10,009个基因下调。这些差异表达基因与KEGG mTOR通路基因集的交集分析，共鉴定出96个在HGSOC中显著失调的mTOR通路基因。火山图和维恩图（图2A和2B）以及后续的热图（图2C）清晰地展示了这些差异基因的分布以及肿瘤与正常样本间的聚类分离。热图显示，其中55个基因上调，41个基因下调。
核心通路特征：mTORC1/2复合物的核心基因，包括mTOR、Deptor、Raptor、mLST8、AKT1S1和MAPKAP1均显示上调，唯独Rictor下调。同时，上游抑制因子DEPDC5和TSC1表达下调。这些变化共同指向HGSOC中mTOR信号通路的转录重编程，其特征是上游效应器的激活与选择性抑制因子的减弱并存。
通路映射与功能分析：将差异表达的mTOR通路基因映射到KEGG mTOR通路上（图3），可以更直观地观察失调模式。分析揭示了几点关键发现：
- 1.
IGF-1信号偏向RAS-RAF-MEK-ERK通路：由IGF-1上调、IRS1下调和GRB2上调驱动，而对PI3K的依赖性较低。
- 2.
mTORC1激活与mTORC2抑制的失衡：AKT1上调、AKT3下调和Rictor的下调，导致信号通路从mTORC2向mTORC1倾斜。
- 3.
能量压力与氨基酸感应机制失调：AMPK（AMP依赖的蛋白激酶）激活相关的CAB39L、STRADA和LKB1下调，削弱了能量压力对mTORC1的抑制。同时，氨基酸感应机制显著激活，表现为氨基酸转运蛋白SLC7A5、Ragulator和RagD上调，而Sestrins、DEPDC5和FLCN/FNIP复合物下调。
功能富集分析（图4）进一步确认了上述发现，除了与“TOR信号”相关的通路外，与“自噬调控”、“经典Wnt信号通路”、“蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性”以及“PI3K-Akt信号通路”、“AMPK信号通路”相关的条目也显著富集。
3.2. 高级别浆液性卵巢癌中mTOR通路基因的调控性miRNA网络
miRNA差异表达：对相同队列的miRNA分析发现了1333个差异表达miRNA，其中621个达到显著性阈值。在这些miRNA中，546个上调，75个下调（图5B）。
miRNA-mTOR调控网络构建：通过整合多个数据库的预测结果，并筛选在至少两个数据库中得到预测的相互作用，最终获得了381个高置信度的miRNA-mTOR基因对。进一步从中鉴定出64个经过实验验证的相互作用对，并保留了其中43个呈逆向表达模式（即上调miRNA靶向下调基因，或下调miRNA靶向上调基因）的调控对，用于构建mTOR-miRNA调控网络（图6）。
枢纽节点识别：通过度中心性分析识别出网络中的关键枢纽节点。在miRNA中，hsa-let-7f-5p、hsa-let-7c-5p和hsa-let-7a-5p（均属于let-7家族）的连接度最高，其次是hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-30a-5p和hsa-miR-222-3p。在mTOR通路基因中，FNIP2的连接度最高，其次是FNIP1。GRB10、RPS6KB1、ULK1、WNT9A、TSC1、RICTOR和INSR也被鉴定为枢纽基因。
关键发现：let-7a-5p、let-7c-5p和let-7f-5p这三个高度连接的miRNA共同靶向一组关键的mTOR相关基因，包括FNIP1、FNIP2、INSR、RICTOR、TSC1和WNT9A。这些miRNA均被注释在KEGG的“癌症中的MicroRNA”通路中，凸显了它们在癌症发生发展中的潜在重要性。
枢纽基因的诊断与预后潜力：使用这六个枢纽基因（RICTOR, FNIP1, FNIP2, TSC1, INSR, WNT9A）的表达数据进行T-SNE降维分析，结果显示TCGA肿瘤样本与GTEx正常组织样本能够被清晰区分（图7A），表明这些基因组合具有作为诊断标志物面板的潜力。随后的Kaplan-Meier生存分析发现，在这六个基因中，FNIP1的表达水平与患者总生存期显著相关。高表达FNIP1的患者预后更好（图7B），其风险比（HR）为1.73，意味着低表达患者的死亡风险是高表达患者的1.73倍。
讨论
本研究通过对化疗初治HGSOC样本的整合分析，描绘了mTOR通路在转录和转录后水平的失调全景图。研究发现HGSOC中IGF-1信号依赖较少，而Rictor的下调和TSC1的抑制共同推动了mTORC1的持续激活。通路富集分析提示了mTOR与Wnt信号通路之间存在复杂的串扰，GSK3β的上调和DVL3的下调需要进一步的功能研究来阐明其确切机制。
研究中最引人注目的发现之一是氨基酸感应机制的失调，特别是FLCN/FNIP复合物（FNIP1, FNIP2）的下调。这破坏了AMPK轴，导致转录因子TFEB/TFE3入核，激活了自噬和溶酶体生物合成相关基因，包括RAG-D，后者又反过来增强Rag GTPase介导的mTORC1激活。这种模式导致了mTORC1激活与自噬增强看似矛盾的同时发生，这可能是一种肿瘤促进适应机制，使癌细胞在代谢压力下通过自噬维持营养平衡以支持其生存和生长。
let-7 miRNA家族的核心作用：该研究将let-7 miRNA家族（let-7a-5p, let-7c-5p, let-7f-5p）置于mTOR通路调控网络的中心。这些miRNA的共上调靶向了包括RICTOR和FNIP1在内的多个关键抑制因子。这与先前在其他癌症（如胃癌）中的研究一致，即let-7a通过靶向RICTOR来促进自噬。在HGSOC背景下，let-7介导的RICTOR和FNIP1下调，可能通过重编程AKT磷酸化（减少S473磷酸化，增加T308磷酸化），将信号平衡转向mTORC1激活和自噬，从而促进代谢适应。
局限性：本研究的一个主要局限性在于使用了GTEx的整个卵巢组织作为正常对照，其中包含基质和滤泡等异质细胞群。而HGSOC现在被广泛认为主要起源于输卵管上皮。因此，观察到的部分差异表达可能反映了组织成分差异，而不仅仅是癌症特异性的失调。
结论
本研究为HGSOC中mTOR信号通路提供了整合的转录组学和转录后调控概述。研究确定了let-7 miRNA家族成员（let-7a-5p, let-7c-5p, let-7f-5p）是HGSOC中mTOR信号网络的核心调控节点，它们共同靶向FNIP1、RICTOR等关键基因，将代谢与自噬调控联系起来。mTORC1与自噬的双重激活模型提出了一种癌症促进性适应机制，使肿瘤细胞能够在代谢压力下维持细胞内营养平衡并存活。该模型代表了一个尚未被充分研究的领域，未来的体外和体内研究对于验证所识别的调控关系，并阐明它们在HGSOC的mTOR信号和代谢适应框架中的功能意义至关重要。
